大鼠內(nèi)耳前體細(xì)胞的增殖研究*

曾亮 江紅群

耳蝸在聲音傳導(dǎo)中充當(dāng)著重要角色，耳蝸毛細(xì)胞或與之相關(guān)聯(lián)的螺旋神經(jīng)元的缺失或退化是導(dǎo)致絕大多數(shù)感音性聾的元兇[1]。Jero等[2]認(rèn)為未來內(nèi)耳疾病的主要治療方式將是基因?qū)?、生長因子注入以及干細(xì)胞移植，以恢復(fù)內(nèi)耳的生物學(xué)基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。李華偉等[3]于2003年首次發(fā)現(xiàn)成年鼠內(nèi)耳前庭器官存在干細(xì)胞，江紅群等[4]亦報(bào)道耳蝸Corti器細(xì)胞培養(yǎng)可見細(xì)胞球形成，90．1%的球內(nèi)細(xì)胞BrdU表達(dá)陽性，為未來感音神經(jīng)性聾的治療帶來了希望。本研究擬通過解剖不同天齡SD大鼠的內(nèi)耳前庭器官及耳蝸Corti器，獲得內(nèi)耳前體細(xì)胞，以探討不同年齡及生長因子對大鼠內(nèi)耳前體細(xì)胞體外增殖的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生后1天(P1)、7天(P7)、14天(P14)、21天(P21)、30天(P30)、60天(P60)的清潔級合格SD大鼠，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)科部提供。

1.2主要試劑 胰酶-EDTA、無血清培養(yǎng)添加劑B27、N2為美國GIBCO公司的產(chǎn)品；嗜熱菌蛋白酶購自美國Sigma公司；胎牛血清、DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)液購于美國HyClone公司；生長因子EGF、bFGF、IGF-1為美國Peprotech公司產(chǎn)品，生長因子LIF購自美國Millipore公司；Mouse anti-Nestin monoclonal antibody購于美國Santa Cruz公司，Mouse anti-Brdu monoclonal antibody為北京中彬金橋生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品；FITC標(biāo)記的抗大鼠IgG為北京中彬金橋生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品；青/鏈霉素雙抗、低溶點(diǎn)瓊脂糖、BrdU購于北京Solarbio公司。

1.3內(nèi)耳前體細(xì)胞的獲得[3,4]選取出生后1、7、14、21、30、60天(P1、P7、P14、P21、P30、P60)的健康SD大鼠各12只(24耳)，共72只(144耳)，取耳蝸Corti器和前庭器官各36只(72耳)。麻醉、消毒后置于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺上，斷頭，去除皮毛，無菌狀態(tài)下分離出雙側(cè)顳骨，置入超凈臺中一含PBS(pH 7.4，冰浴)緩沖液的培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下完整暴露耳蝸和前庭。

1.3.1耳蝸 Corti器的分離 從上至下分離解剖開螺殼，暴露聽覺上皮，用眼科鑷細(xì)心將周圍的螺旋緣和血管紋剝離，完整地將基底膜(包含有Corti器)與蝸軸分離開，移至一含有PBS液的離心管中，機(jī)械粉碎后在4 ℃恒溫離心機(jī)中2 000 rpm離心5分鐘。棄上清液，加入1 ml的0.125%胰酶，37 ℃環(huán)境下消化15分鐘后，加入1 ml含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化5分鐘，用燒口玻璃移液管吹打10余次，使單細(xì)胞從膜組織中脫落。

1.3.2球囊斑、橢圓囊斑感覺上皮的分離 使用尖針分別從蝸頂及圓窗挑破并移除耳蝸，自上而下暴露前庭器官，鏡下可見兩個(gè)相距不遠(yuǎn)的白色斑塊，其中位于前庭后上方的為橢圓囊斑，位于前庭前下方的為球囊斑，利用尖針以及纖維鑷小心分別完整游離出兩個(gè)斑塊，PBS液(pH 7.4，冰浴)漂洗后轉(zhuǎn)移至含有嗜熱菌蛋白酶(0.5 mg/ml)的試管中，消化30分鐘后，獲得純凈的橢圓囊斑或球囊斑感覺上皮，置入含有1 ml 0.125%胰蛋白酶的試管中，37 ℃環(huán)境下消化10分鐘后，加入1ml含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化5分鐘，用燒口玻璃移液管輕柔吹打10余次，使單細(xì)胞從膜組織中脫落。

1.3.3細(xì)胞收集及原代培養(yǎng) 分別收集上述兩組細(xì)胞混合液于離心管中，在4 ℃恒溫離心機(jī)中1 000 rpm/min離心沉降5分鐘，棄上清液，添加適量配置好的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM/F12+ B27+ N2)，重新制成細(xì)胞懸液，經(jīng)50 μm的細(xì)胞濾網(wǎng)濾去較大的組織殘骸以及碎片后，接種至經(jīng)上述處理后的48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，定容成密度為1×104的細(xì)胞懸液，置入培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2的細(xì)胞孵箱內(nèi)，無血清低密度懸浮培養(yǎng)7天，每2天換半液一次。在倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)、拍照。

1.4細(xì)胞球的定量研究及其數(shù)量變化曲線描繪

1.4.1計(jì)數(shù)細(xì)胞球標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞呈球形或者橢球形，通過目鏡測微尺在低倍視野下，耳蝸Corti器所獲的細(xì)胞球直徑約等于或大于100 μm，球囊斑和橢圓囊斑所獲的細(xì)胞球直徑約等于或大于50 μm；若有數(shù)個(gè)重疊的細(xì)胞球，則按一個(gè)計(jì)數(shù)，貼壁細(xì)胞球不參與計(jì)數(shù)。

1.4.2細(xì)胞球數(shù)量曲線描繪 統(tǒng)計(jì)分析各天齡細(xì)胞球數(shù)據(jù)(耳蝸Corti器、球囊斑、橢圓囊斑)，計(jì)數(shù)資料以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差表示，以年齡為橫軸，細(xì)胞球數(shù)的平均數(shù)值為縱軸(以0作為起點(diǎn))，采用SPSS 17.0軟件制作折線圖。

1.5表皮生長因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、胰島素樣生長因子(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)對內(nèi)耳高增殖細(xì)胞增殖的影響 另選取健康P1 SD大鼠24只，分為每組6只(12耳)，按前述獲取內(nèi)耳高增殖細(xì)胞及其培養(yǎng)方法，將單個(gè)耳蝸Corti器、球囊斑、橢圓囊斑三種內(nèi)耳器官所獲細(xì)胞分別隨機(jī)接種到五組不同培養(yǎng)液中，其中不含生長因子培養(yǎng)條件下所獲得的細(xì)胞球設(shè)為對照組，實(shí)驗(yàn)組則分別按照加的四種不同生長因子劃分為四組：EGF組，bFGF組，IGF-1組，LIF組，均為20 ng/ml；懸浮培養(yǎng)，在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞孵箱內(nèi)懸浮培養(yǎng)7天，每2天換半液一次；第8天在倒置相差顯微鏡下以上述采納標(biāo)準(zhǔn)對所獲細(xì)胞球數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)、拍照。

1.6細(xì)胞及細(xì)胞球特性鑒定

1.6.1貼壁 在超凈臺內(nèi)，將預(yù)先準(zhǔn)備好的特制爬片置入24孔培養(yǎng)板中(賴氨酸面朝上)，收集P1SD大鼠剛?cè)〔牡膬?nèi)耳高增殖細(xì)胞和經(jīng)懸浮培養(yǎng)7天后所獲得的細(xì)胞球，分別接種在特制爬片上，每孔均滴加適量含胎牛血清的培養(yǎng)液(10%FBS+DMEM/F12+B27+N2)進(jìn)行誘導(dǎo)貼壁，在37 ℃、5% CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，新分離的單細(xì)胞誘導(dǎo)貼壁6小時(shí)，而細(xì)胞球則誘導(dǎo)貼壁16小時(shí)；倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞及細(xì)胞球貼壁情況，撈取貼壁良好的爬片置入新的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，PBS緩沖液常溫下漂洗3次，4%的多聚甲醛溶液固定30分鐘，而后進(jìn)行免疫細(xì)胞的化學(xué)熒光染色。

1.6.2免疫熒光標(biāo)記 單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行nestin免疫熒光染色，而細(xì)胞球團(tuán)分別進(jìn)行nestin及BrdU免疫熒光染色。進(jìn)行BrdU染色的細(xì)胞球在貼壁之前需通過含有BrdU試劑(10 μmol/L)的無血清培養(yǎng)液對內(nèi)耳高增殖能力細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)7天后獲取。①適量PBS液(0.01 mol/L，pH 7.4)漂洗3次，加入0.3%TritonX-100增加細(xì)胞通透性；② PBS漂洗3次后，用封閉劑(0.1%TritonX-100和10%封閉用山羊血清)室溫下封閉30分鐘；③滴加適量稀釋后的一抗nestin(1:100)或BrdU(1:200)在爬片上，務(wù)必覆蓋整個(gè)表面，置入濕盒內(nèi)，避光，4 ℃環(huán)境下過夜；④0.1%TritonX-100液室溫下漂洗3次；⑤滴加按比例稀釋的二抗：FITC標(biāo)記的山羊抗大鼠(1:100)，置入37 ℃孵箱內(nèi)，避光，50分鐘；⑥ PBS液漂洗3次，加入少量DAPI染色液染核；⑦PBS液漂洗3次，封片，熒光顯色，拍照。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS17.0軟件，對結(jié)果進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞球的形態(tài) 第8天，孔內(nèi)形成的球團(tuán)數(shù)量不再變化，故選取培養(yǎng)7天后的細(xì)胞球進(jìn)行計(jì)數(shù)，大多數(shù)形狀規(guī)則呈球形或橢球形(圖1)。相同培養(yǎng)環(huán)境下，添加適量生長因子的實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)7天后同樣倍數(shù)的視野下觀察，可看見簇?fù)砘蛑丿B在一起的細(xì)胞球(圖2)。

圖1 培養(yǎng)第8天所形成的細(xì)胞球(×400)

2.2細(xì)胞球數(shù)量的增齡性變化

2.2.1單個(gè)耳蝸Corti器 P1及P7 SD大鼠耳蝸內(nèi)所取細(xì)胞在無血清懸浮培養(yǎng)的條件下，隨時(shí)間增長，可見數(shù)量不等的細(xì)胞球形成，形態(tài)多呈規(guī)則的球形或橢球形，P1大鼠單個(gè)Corti器可形成細(xì)胞球數(shù)為50±23個(gè)，P7大鼠為33±15個(gè)，總體均數(shù)相等，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(方差分析，P=0.041<0.05)。隨著天齡的增長，形成的細(xì)胞球數(shù)量呈下降趨勢，而P14、P21、P30、P60大鼠所取細(xì)胞同樣條件下培養(yǎng)，無細(xì)胞球形成，其內(nèi)可能不存在增殖細(xì)胞。

2.2.2球囊斑、橢圓囊斑 P1、P7、P14、P21、P30、P60 SD大鼠所取細(xì)胞在無血清懸浮培養(yǎng)的條件下，隨時(shí)間增長，可見數(shù)量不等的細(xì)胞球形成，形態(tài)多呈規(guī)則的球形或橢圓形，與耳蝸Corti器內(nèi)前體細(xì)胞所形成的球體相比，其數(shù)量較少，直徑較小。分別統(tǒng)計(jì)各天齡段球囊斑組及橢圓囊斑組形成的細(xì)胞球數(shù)，并進(jìn)行方差分析(多個(gè)樣本均數(shù)間的多重比較)，總體方差不全相等，(方差齊性Levene檢驗(yàn)，F(xiàn)=0.002和0.011，均小于0.10)，將所有數(shù)值對數(shù)變換后再行檢驗(yàn)得F值大于0.10，符合方差齊性。將變換后數(shù)據(jù)列表進(jìn)行多樣本均數(shù)間多重比較結(jié)果見表1、2。各天齡段大鼠球囊斑及橢圓囊斑形成的細(xì)胞球數(shù)平均值繪成的折線圖見圖3，可見總體趨勢均表現(xiàn)為隨著天齡的增長，形成的細(xì)胞球數(shù)量下降。球囊斑高增殖細(xì)胞減少主要集中在出生后第1天至21天，而橢圓囊斑高增殖細(xì)胞減少主要集中在出生后第1天至30天；除出生后21天的大鼠外，其他同天齡段大鼠兩種前庭器官內(nèi)高增殖細(xì)胞的增殖能力無差異。

表1 各天齡段SD大鼠單個(gè)球囊斑形成細(xì)胞球數(shù)(個(gè)，及統(tǒng)計(jì)P值

表2 各天齡段SD大鼠單個(gè)橢圓囊斑形成細(xì)胞球數(shù)(個(gè)，及統(tǒng)計(jì)P值

圖3 培養(yǎng)7天后，P1至P60大鼠球囊斑和橢圓囊斑細(xì)胞球數(shù)量均值折線圖

2.3生長因子對細(xì)胞球數(shù)量的影響 與對照組比較，添加了EFG、bFGF、IGF-1的培養(yǎng)板中單個(gè)器官細(xì)胞球數(shù)量明顯增加(P<0.01)，而添加LIF因子的培養(yǎng)液中細(xì)胞球數(shù)目則無明顯變化(P>0.05)(表3～5)。

表3 P1大鼠各組單個(gè)耳蝸Corti器形成細(xì)胞球數(shù)(個(gè)，及統(tǒng)計(jì)P值

表4 P1大鼠各組單個(gè)球囊斑形成細(xì)胞球數(shù)(個(gè)，及統(tǒng)計(jì)P值

表5 P1大鼠各組單個(gè)橢圓囊斑形成細(xì)胞球數(shù)(個(gè)，及統(tǒng)計(jì)P值

2.4內(nèi)耳高增殖細(xì)胞及所形成細(xì)胞球的免疫熒光特性

2.4.1耳蝸Corti器、球囊斑、橢圓囊斑所獲懸浮單細(xì)胞，貼壁后經(jīng)抗體nestin熒光染色標(biāo)記后可見，其中有細(xì)胞染色陽性，表達(dá)出神經(jīng)干細(xì)胞的特性(圖4)。

2.4.2特異性BrdU抗體染色標(biāo)記后可見，大部分球內(nèi)細(xì)胞的細(xì)胞核染色陽性，表明球團(tuán)內(nèi)存在有自我更新能力的細(xì)胞(圖5)；特異性的nestin抗體染色可見球內(nèi)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)同樣呈現(xiàn)出陽性反應(yīng)，可以認(rèn)為該球團(tuán)由有神經(jīng)干細(xì)胞特性的細(xì)胞增殖分裂而來(圖6)。

圖4 單細(xì)胞免疫熒光染色圖片 表現(xiàn)為nestin陽性(a～c分別為nestin、DAPI、融合圖像)

圖5 細(xì)胞球團(tuán)免疫熒光染色圖像 球團(tuán)內(nèi)細(xì)胞的細(xì)胞核表現(xiàn)為BrdU陽性(a～c分別為BrdU、DAPI、融合圖像)

圖6 細(xì)胞球團(tuán)免疫熒光染色圖像 球體內(nèi)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)表現(xiàn)為nestin陽性(a～c分別為nestin、DAPI、融合圖像)

3 討論

3.1內(nèi)耳細(xì)胞及細(xì)胞球的干細(xì)胞特性 以細(xì)胞技術(shù)治療感音神經(jīng)性聾，主要目的就是重塑內(nèi)耳結(jié)構(gòu)，恢復(fù)生理功能，可以通過自體、同種異體或者是異種的干細(xì)胞內(nèi)耳移植與損傷處內(nèi)耳細(xì)胞自我修復(fù)兩種途徑實(shí)現(xiàn)，其中關(guān)于細(xì)胞移植的研究已進(jìn)行了數(shù)十年，相比于它，后者更是一種讓人滿意、充滿前途和希望的治療方式[5]。內(nèi)耳細(xì)胞自身修復(fù)方式主要包括內(nèi)耳干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化以及支持細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。本世紀(jì)初即有學(xué)者自內(nèi)耳前庭器官感覺上皮內(nèi)分離出有高增殖能力的細(xì)胞[3]，近幾年來亦有學(xué)者不斷從哺乳動(dòng)物耳蝸、橢圓囊斑等器官的感覺上皮中提取細(xì)胞，體外懸浮培養(yǎng)形成細(xì)胞球[6～8]，他們認(rèn)為這些從耳內(nèi)特殊區(qū)域所獲得的增殖細(xì)胞，具有修復(fù)或替代損傷感覺上皮的功能，是未來臨床治療耳聾的關(guān)鍵。亦有研究者在體外特定的環(huán)境下將人的骨髓間葉干細(xì)胞[9]和多能干細(xì)胞[10]增殖誘導(dǎo)分化成內(nèi)耳前體細(xì)胞，并表達(dá)其特性。本研究分離SD大鼠內(nèi)耳三大器官的的感覺上皮細(xì)胞，在體外無血清懸浮培養(yǎng)后，得到了大量細(xì)胞球，并分別對單細(xì)胞及細(xì)胞球進(jìn)行了干細(xì)胞的特性鑒定，證實(shí)其具有干細(xì)胞的特征。

3.2干細(xì)胞增殖能力的增齡變化 在細(xì)胞移植治療疾病的實(shí)驗(yàn)中，高增殖能力的細(xì)胞可提高成功率，干細(xì)胞具有高增殖分化能力的特性，但其增生分裂的能力受多種因素影響，包括生存微環(huán)境、某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、核內(nèi)DNA損傷以及干細(xì)胞自身的衰老。兔的角膜緣干細(xì)胞能表達(dá)特異的細(xì)胞膜蛋白，利用RT-PCR可以檢測到該標(biāo)志物的mRNA含量，將白兔分成青年、中年、老年3組，培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞表達(dá)的標(biāo)志物mRNA隨年齡增長逐漸下降，為非線性過程[11]。有學(xué)者[12]結(jié)扎大鼠的冠脈造成心肌梗死后迅速注入人間質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem ceds,hMSCs)，分別于注入后1、2、4周測試心功能，發(fā)現(xiàn)年幼的hMSCs提高心梗后心功能的效果要高于衰老的hMSCs。

本研究通過比較不同天齡的SD大鼠相同器官內(nèi)耳單細(xì)胞體外懸浮培養(yǎng)形成細(xì)胞球數(shù)量，發(fā)現(xiàn)來源于P1耳蝸內(nèi)的高增殖細(xì)胞較來源于P7的細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)，而P14及以后各天齡段大鼠耳蝸內(nèi)細(xì)胞無細(xì)胞球形成。推測大齡鼠的耳蝸內(nèi)高增殖細(xì)胞基本分化為終末細(xì)胞，也可能是由于體外培養(yǎng)條件不能誘導(dǎo)該類增殖細(xì)胞恢復(fù)增殖能力。另外，文中結(jié)果顯示前庭器官內(nèi)高增殖細(xì)胞表現(xiàn)為隨著年齡的增長，呈現(xiàn)出下降態(tài)勢；與前庭器官比較，耳蝸Corti器內(nèi)高增殖細(xì)胞的增殖能力減退更快，出生后14天大鼠耳蝸內(nèi)Corti器即未能發(fā)現(xiàn)高增殖細(xì)胞，前庭器官內(nèi)高增殖細(xì)胞的增殖能力下降緩慢，持續(xù)至出生后60天仍可見高增殖細(xì)胞。

3.3不同生長因子對干細(xì)胞增殖能力的影響 細(xì)胞工程學(xué)的目的是將增殖細(xì)胞移植入損傷組織內(nèi)，誘導(dǎo)其增殖分化，以替換這些病態(tài)細(xì)胞，在這個(gè)過程中，生長因子扮演了重要的調(diào)控角色。近年來發(fā)現(xiàn)不同生長因子可促進(jìn)或抑制增殖細(xì)胞的增殖能力，NGF可以促進(jìn)MSCs的增殖，并激活PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路，以誘導(dǎo)其分化生成血管[13]；Keerl等[14]在研究新分離的脂肪干細(xì)胞增殖分化成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的過程中，發(fā)現(xiàn)PDGF聯(lián)合bFGF在其中起到?jīng)Q定性作用；文獻(xiàn)[15～17]報(bào)導(dǎo)EGF、bFGF、IGF-1以及LIF這4種生長因子可影響增殖細(xì)胞的增殖能力。本研究同樣發(fā)現(xiàn)在添加了EGF、bFGF、IGF-1生長因子的實(shí)驗(yàn)組中，細(xì)胞球團(tuán)數(shù)量較空白對照組明顯增多，但對細(xì)胞球的形態(tài)和體積無明顯影響，因此認(rèn)為這3種生長因子對內(nèi)耳高增殖細(xì)胞的增生分裂有促進(jìn)作用；而LIF對于內(nèi)耳器官增殖細(xì)胞則沒有明顯的促增生分裂作用，與李華偉等[3]研究結(jié)果相符，但也有研究[18]稱LIF可促進(jìn)來源于SGNs的神經(jīng)干細(xì)胞的增生分裂，而抑制其分化。

內(nèi)耳高增殖細(xì)胞相對其他干細(xì)胞具有巨大優(yōu)勢，如果可以通過激發(fā)損傷部位原有的增殖細(xì)胞增生分化出新的功能細(xì)胞來修復(fù)或補(bǔ)充受損細(xì)胞，不僅可以避免體外增殖細(xì)胞耳內(nèi)移植的繁瑣步驟和風(fēng)險(xiǎn)，而且可以避免異種細(xì)胞排斥的問題。本研究還發(fā)現(xiàn)某些生長因子對內(nèi)耳器官增殖細(xì)胞的增殖能力有促進(jìn)作用，為未來探討影響內(nèi)耳增殖細(xì)胞增生分裂的微環(huán)境奠定了基礎(chǔ)，Okano等[19]觀察到IGF因子信號途徑可以調(diào)控小鼠耳蝸內(nèi)感覺細(xì)胞的分化時(shí)間，為未來調(diào)控內(nèi)耳增殖細(xì)胞分化能力提供新的方向。

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