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    玉米胚芽蛋白提取及組成成分分析

    2014-06-11 00:46:02丁繼峰鹿保鑫張東杰
    中國(guó)糧油學(xué)報(bào) 2014年2期
    關(guān)鍵詞:胚芽回歸方程淀粉酶

    王 霞 丁繼峰 鹿保鑫 張東杰

    (黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1,大慶 163319)(黑龍江省雙鴨山市友誼縣食品藥品監(jiān)督管理局2,雙鴨山 155800)

    蛋白質(zhì)是人體維持正常生命活動(dòng)最基本的物質(zhì),人體每天必須從食物中攝取一定量的蛋白質(zhì),補(bǔ)充必需氨基酸的攝入量,從而維持人體的正常生活和生命需要[1-3]。玉米胚芽含有豐富的脂肪和蛋白資源,其中胚芽蛋白具有良好的功能性質(zhì),可以作為食品添加劑添加到食物當(dāng)中從而改善食物的感官和組織特性,提高產(chǎn)品品質(zhì),提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,玉米胚芽中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在20%左右,主要為白蛋白和球蛋白,且玉米胚芽蛋白中富含多種人體必需氨基酸,其中賴氨酸和色氨酸含量相對(duì)較高,特別是賴氨酸高達(dá)5.8%左右[4-5]。本研究首先采用超臨界CO2萃取方法制備脫脂玉米胚芽粉,利用酶法和堿溶酸沉法[6-11]相結(jié)合的提取玉米胚芽粉中的蛋白。探討酶添加量、提取溫度和pH等因素對(duì)玉米胚芽蛋白提取率的影響,對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化組合,對(duì)提取物中氨基酸組成進(jìn)行了測(cè)定。

    1 材料與方法

    1.1 原料與試劑

    脫脂玉米胚芽粉:自制。α-淀粉酶:北京奧得星生物技術(shù)有限公司;氫氧化鈉:南京化學(xué)試劑有限公司;鹽酸:南京化學(xué)試劑有限公司;SDS(十二烷基磺酸鈉):北京康倍斯科技有限公司;Acr(丙烯酰胺):北京康倍斯科技有限公司;甘氨酸:天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠;溴酚藍(lán):天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠;考馬斯亮藍(lán)R250:上海化學(xué)試劑有限公司等;以上均為分析純。

    1.2 主要儀器

    HA121-50-01超臨界流體萃取裝置:南通市華安超臨界萃取有限公司;T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;F-160粉碎機(jī):北京市永光明醫(yī)療儀器廠;DELTA 320 型酸度計(jì):梅特勒—托制多儀器(上海)有限公司;SPD50自動(dòng)定氮儀:北京三品科技儀器有限公司;L-8800全自動(dòng)氨基酸分析儀:日本日立公司。

    1.3 方法

    1.3.1 玉米胚芽蛋白提取的工藝流程

    玉米胚芽→脫除脂肪→玉米胚芽蛋白提取液→調(diào)節(jié)pH 9.0→加溫?cái)嚢琛?次離心→提取上清液→調(diào)pH 6.3加α-淀粉酶→65 ℃酶解→調(diào)pH→2次離心→沉淀脫鹽→蛋白含量測(cè)定

    1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    選擇對(duì)玉米胚芽蛋白提取效果有影響的4個(gè)主要因素:α-淀粉酶添加量X1,提取溫度X2,酶解時(shí)間X3,酸沉pHX4,以蛋白提取率為考核標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

    1.3.3 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,確定中心組合因素(α-淀粉酶添加量、提取溫度、酶解時(shí)間、提取pH)與水平。以玉米胚芽蛋白提取率為響應(yīng)值,通過(guò)二次回歸正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。變量參數(shù)P=4;星號(hào)臂值R=2;±1水平的因素點(diǎn)試驗(yàn)全部實(shí)施為Mc=2P=16;±R水平的星號(hào)臂點(diǎn)為MR=2P=8;為了使得二次旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)具有正交性,各因素是零水平的中心為M0=12;總試驗(yàn)點(diǎn)N=MC+MR+M0=36。

    1.3.4 玉米胚芽蛋白提取率的測(cè)定

    玉米胚芽提取率=

    1.3.5 玉米胚芽蛋白的電泳檢測(cè)

    采用垂直板電泳,根據(jù)表1濃縮膠分離膠配方依次灌膠,制備樣品,混勻冷卻后上樣,在90 V恒流條件下1 h,后100 V恒流條件下電泳3 h。電泳完畢后染色、脫色直至背景清晰為止。

    1.3.6 玉米胚芽蛋白的氨基酸組分測(cè)定

    大多數(shù)氨基酸與茚三酮衍生物呈藍(lán)紫色,在570 nm處有最大吸收;脯氨酸與茚三酮衍生物呈黃色,在440 nm處有最大吸收,根據(jù)這一特點(diǎn),采用氨基酸全自動(dòng)分析儀,進(jìn)行玉米胚芽蛋白的氨基酸組分測(cè)定。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 玉米胚芽蛋白提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 α-淀粉酶添加量對(duì)玉米胚芽蛋白提取率的影響

    圖1中的試驗(yàn)條件為玉米胚芽溶液的料液比為1∶10,提取溫度為65 ℃,酸沉pH為4.0,酶解時(shí)間2 h,α-淀粉酶添加量分別在0.1%、0.2%、0.3%、0.4%進(jìn)行研究,從圖1可以看出,α-淀粉酶的添加量在0.1%~0.3%之間時(shí),隨著α-淀粉酶添加量的增加玉米胚芽蛋白提取率而顯著增加,在添加量為0.3%時(shí),提取率達(dá)到最高值62.81%。繼續(xù)增加α-淀粉酶添加量時(shí),蛋白提取率有所下降。因此選取α-淀粉酶的最適添加量為0.3%。

    圖1 α-淀粉酶添加量對(duì)玉米胚芽蛋白提取率的影響

    2.1.2 提取溫度對(duì)玉米胚芽蛋白提取率的影響

    圖2中的試驗(yàn)條件為玉米胚芽溶液的料液比為1∶10,α-淀粉酶添加量為0.3%,酸沉pH為4.0,酶解時(shí)間2 h,提取溫度分別25~75 ℃進(jìn)行試驗(yàn)以測(cè)定玉米胚芽蛋白的提取率,其中提取溫度在25~65 ℃之間時(shí),玉米胚芽蛋白提取率隨著提取溫度的上升而顯著增加,在溫度為65 ℃時(shí),蛋白提取率達(dá)到最大為61.74%。繼續(xù)升高時(shí),蛋白提取率有所下降,可能是因?yàn)檫^(guò)高的溫度使蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變甚至變性所致。根據(jù)溫度對(duì)玉米胚芽蛋白提取率的影響關(guān)系曲線選取最適提取溫度為65 ℃。

    圖2 提取溫度對(duì)玉米胚芽蛋白提取率的影響

    2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)玉米胚芽蛋白提取率的影響

    圖3的試驗(yàn)條件為玉米胚芽溶液的料液比為1∶10,提取溫度為65 ℃,在α-淀粉酶添加量為0.3%,酸沉pH為4.0,酶解時(shí)間分別為0.5~2.5 h條件下進(jìn)行試驗(yàn),隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng),玉米胚芽蛋白提取率逐漸增加,在2 h以后達(dá)到平衡,繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間對(duì)蛋白提取率的提高影響不大。根據(jù)酶解時(shí)間對(duì)玉米胚芽蛋白提取率的影響關(guān)系曲線選取最適酶解時(shí)間2 h。

    圖3 酶解時(shí)間對(duì)玉米胚芽蛋白提取率的影響

    2.1.4 PH對(duì)玉米胚芽蛋白提取率的影響

    圖4中試驗(yàn)條件為玉米胚芽溶液的料液比為1∶10,提取溫度為65 ℃,在α-淀粉酶添加量為0.3%,酶解時(shí)間為2h,酸沉pH為3.0~5.0,進(jìn)行試驗(yàn),在pH在4.0時(shí),蛋白提取率達(dá)到最大為61.99%。pH在小于或者大于4.0時(shí),蛋白提取率較低,說(shuō)明玉米胚芽蛋白的等電點(diǎn)在4.0左右,偏離等電點(diǎn)時(shí),一部分蛋白重新被溶解,蛋白含量有所降低。因此選擇pH為4.0做為二次回歸正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)的最優(yōu)水平。

    圖4 pH對(duì)玉米胚芽蛋白提取率的影響

    2.2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

    2.2.1 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)結(jié)果

    二次回歸旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

    表1 試驗(yàn)因素水平編碼表

    表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

    表2(續(xù))

    回歸方程的方差分析及F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表3、表4和表5。

    表3 F檢驗(yàn)分析表

    表4 回歸方程各項(xiàng)的方差分析表

    表5 t檢驗(yàn)方差分析表

    對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,以玉米胚芽蛋白提取率作為衡量指標(biāo)即Y值,得到以4種影響因素的編碼值為自變量的回歸方程如下:

    Y=-390.655 764+124.684 945X1+9.891 081X2+27.151 451X3+46.218 900X4-151.078 556X12+1.270 573X1X2-0.091 431X22-23.998 524X1X3+0.112 030X2X3-9.704 570X32-14.894 267X1X4+0.262 115X2X4+3.640 295X3X4-8.243 142X42

    回歸方程顯著性分析結(jié)果:F1=38.57>F0.01=3.03,說(shuō)明差異極顯著。失擬性檢驗(yàn)F2=2.27

    2.2.1.1主效應(yīng)分析

    4種因素對(duì)玉米胚芽蛋白提取率的影響程度見(jiàn)表6,由表可以得出4種因素對(duì)玉米胚芽蛋白提取率的影響順序?yàn)椋篨2>X3>X1>X4,即提取溫度對(duì)玉米胚芽蛋白提取率影響最大,酶解時(shí)間次之,再次為α-淀粉酶添加量,pH對(duì)其影響最小。

    表6 關(guān)鍵因子重要性分析

    2.2.1.2 模擬尋優(yōu)及驗(yàn)證

    對(duì)回歸方程進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬尋優(yōu),結(jié)果見(jiàn)表7,得到玉米胚芽蛋白的最佳提取條件為:α-淀粉酶添加量0.31%,提取溫度63.29 ℃,酶解時(shí)間2.12 h,pH 3.99,理論蛋白提取率為63.12%。根據(jù)實(shí)際操作情況,α-淀粉酶添加量0.3%,提取溫度63 ℃,酶解時(shí)間2 h,pH4.0,為條件進(jìn)行驗(yàn)證,實(shí)際蛋白提取率為61.86%,誤差為2%≤5%,說(shuō)明優(yōu)化模型擬合較好。

    表7 試驗(yàn)結(jié)果

    注:3次測(cè)定值分別為61.79%、61.86%、61.92%的平均值。

    2.2.2 玉米胚芽蛋白電泳檢測(cè)結(jié)果

    對(duì)所提取的玉米胚芽蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果如圖5所示,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白所作的半對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,接合各蛋白遷移率Rf值,可算出玉米胚芽蛋白的分子質(zhì)量為94.5、72.3、55.8、30.2 ku,說(shuō)明提取的玉米胚芽蛋白并不是單一蛋白。

    圖5 蛋白電泳圖

    2.2.3 玉米胚芽蛋白的氨基酸組成測(cè)定結(jié)果

    在酸性條件下,經(jīng)氨基酸全自動(dòng)分析儀檢測(cè),玉米胚芽蛋白中含有7種人體必需氨基酸,見(jiàn)圖6和表8。

    圖6 氨基酸色譜分離圖

    表8 人體所需8種氨基酸與玉胚芽蛋白所含氨基酸對(duì)照表

    注:+表示含有該種氨基酸,—表示不含該種氨基酸。

    3 結(jié)論

    玉米胚芽經(jīng)過(guò)超臨界CO2萃取脫脂后進(jìn)行蛋白提取試驗(yàn),在提取過(guò)程中添加α-淀粉酶,通過(guò)單因素試驗(yàn)考察了α-淀粉酶添加量、提取溫度、酶解時(shí)間以及酸沉pH 4個(gè)因素對(duì)提取玉米胚芽蛋白提取率的影響,并在此單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行四元二次旋轉(zhuǎn)回歸組合試驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化,玉米胚芽蛋白的最佳提取條件為:α-淀粉酶添加量0.3%,提取溫度63 ℃,酶解時(shí)間2 h,pH4.0,所制得玉米胚芽蛋白產(chǎn)品提取率為61.86%。經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)可計(jì)算出玉米胚芽蛋白的分子質(zhì)量為94.5、72.3、55.8、30.2 ku,說(shuō)明提取的玉米胚芽蛋白并不是單一蛋白。在酸性條件下,經(jīng)氨基酸全自動(dòng)分析儀測(cè)定,玉米胚芽蛋白中含有7種人體必需氨基酸:蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸。

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