肺癌A549裸大鼠移植瘤模型的建立及應(yīng)用

曹軍，何陽，劉洪強，王賽博，趙保成，鄭曉輝，程英升

·實驗研究Experimental research·

肺癌A549裸大鼠移植瘤模型的建立及應(yīng)用

曹軍，何陽，劉洪強，王賽博，趙保成，鄭曉輝，程英升

目的探討裸大鼠肺癌A549高效移植瘤模型的建立方法，為進行腫瘤的體內(nèi)相關(guān)介入研究提供實驗基礎(chǔ)。方法肺癌A549細胞接種于裸小鼠皮下，出瘤后制備單細胞懸液和組織塊分別接種和塞入裸大鼠耳后皮下，觀察初次培養(yǎng)細胞成瘤組、二次單細胞懸液成瘤組和二次組織塊成瘤組的出瘤率和移植瘤的生長情況，流式細胞儀檢測細胞周期的變化。結(jié)果3組中二次組織塊成瘤組的出瘤率顯著高于另外兩組，細胞增殖快，移植瘤的變異??；細胞周期分析顯示二次組織塊成瘤組的細胞S和G2/M期比例增高，細胞增殖指數(shù)顯著高于另外兩組。結(jié)論二次組織塊成瘤可顯著提高A549的成瘤率，是一種高效的裸大鼠移植瘤模型建立方法。

A549；移植瘤模型；裸大鼠

肺癌是世界上發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，2010年美國肺癌患者達22.2萬，死亡15.7萬，居所有腫瘤之首［1］。在所有肺癌病例中約85%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），就診時約有2/3患者已失去手術(shù)機會，臨床上為Ⅲ～Ⅳ期［2-3］。以往肺癌基礎(chǔ)研究多用裸小鼠模型，但是，裸小鼠個體小，成瘤后，所獲腫瘤組織較少，且血管纖細無法完成插管，難以行動脈介入方面的研究。為了彌補上述不足，便于開展肺癌介入方面的基礎(chǔ)研究，我們參照裸小鼠腫瘤模型建立方法［4-5］，建立一種高效肺癌A549細胞裸大鼠皮下移植瘤模型，并且進一步比較不同建立方法的可行性和有效性，為開展腫瘤介入相關(guān)藥理及藥效評價提供有效的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

1.1.1.1 裸大鼠：18只，健康，雌雄各半，8～10周齡，體質(zhì)量（180±15）g，飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生中心實驗動物所SPF級動物房，飼以高壓滅菌水和飼料，各組鼠均同等自由飲水、攝食，飼養(yǎng)室相對濕度40%～50%，溫度22～25℃，光照12 h明暗交替。

1.1.1.2 荷瘤裸小鼠：5只，健康BALB/C裸小鼠，4～5周齡，體質(zhì)量（22.1±2.1）g，購自上海市腫瘤研究所。在SPF級動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)，整個實驗過程中，各組鼠均同等自由飲水、攝食，飼養(yǎng)觀察室保持22～25℃，相對濕度40%～50%的SPF層流室中。

1.1.3 實驗藥物及器械麻醉劑鹽酸氯胺酮系上海第一生化藥業(yè)公司生產(chǎn)，按10 mg/100 g實驗鼠體重腹腔注射麻醉。細胞培養(yǎng)過程中所需10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清等均由Gibco公司提供。顯微外科實驗手術(shù)器械購自上海市醫(yī)療器械總公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的建立

1.2.1.1 荷瘤裸小鼠皮下瘤模型的建立：將人肺癌A549株細胞復(fù)蘇、含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)及傳代，取生長良好指數(shù)的人肺癌A549細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，離心，收集細胞用PSB稀釋，濃度調(diào)整為5×106/ml，每只小鼠以0.2m l接種于5只成年BABL/c裸鼠右腋皮下造模，正常飼養(yǎng)8 d后動物接種腫瘤成功。

1.2.1.2 裸大鼠皮下移植瘤模型的建立：根據(jù)裸大鼠移植瘤模型的建立方法不同，分為3組，A組：初次培養(yǎng)細胞成瘤組；B組：二次單細胞懸液成瘤組；C組；二次組織塊成瘤組。每組6只裸大鼠，每只裸大鼠耳后接種一個點。A組用培養(yǎng)的A549細胞1×106個/0.2 ml，接種于裸大鼠耳后皮下；B組用荷瘤裸小鼠皮下移植瘤，待瘤塊最長徑＞1 cm時，將裸小鼠斷頸處死，無菌條件下解剖分離瘤塊，制成篩網(wǎng)法單細胞懸液移植于裸大鼠的耳后皮下；C組用荷瘤裸小鼠皮下移植瘤，同上述方法解剖分離瘤塊，切成2 mm×2 mm×2 mm，再把瘤組織塊移植于裸大鼠的耳后皮下，接種后3組隔天測量移植瘤的長短徑，用游標卡尺測出腫瘤的直徑（A）和橫徑（B），按公式V=1/2×（A×B2）計算腫瘤體積。

1.2.2 細胞周期測定收集1×106細胞，用冰PBS洗兩次，離心1 200 r/min×5min，棄上清液后再重懸于75%乙醇中，測試前用冰PBS洗2次，加入RNAase及碘化丙啶（終濃度為100μg/m l），37℃避光放置15 min，Beckman Coulter公司Cytomics FC500流式細胞儀檢測（激發(fā)波長488 nm，吸收波長為610 nm），每個樣品測定10 000個細胞，ModFit LT 3.2軟件分析細胞周期，并計算增殖指數(shù)（PI），PI=［（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）］×100%［6］。

1.3 統(tǒng)計分析

利用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，采用χ2檢驗和方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

帶狀皰疹的治療首先是針對病因的治療，治療帶狀皰疹病毒必須盡早，最好在疾病初期的3～7天。治療帶狀皰疹的抗病毒藥物有口服的鹽酸伐昔洛韋、泛昔洛韋、阿昔洛韋、溴夫定等，靜點的藥物有膦甲酸鈉、阿糖腺苷、阿昔洛韋、更昔洛韋等，療程10～14天。

2 結(jié)果

2.1 裸大鼠的一般情況

連續(xù)觀察皮下瘤模型56 d。腫瘤細胞皮下注射4～5 d后，8只裸大鼠均在注射處觸及芝麻大的結(jié)節(jié)。7 d后呈直徑4～5 mm的皮下結(jié)節(jié)，14 d后腫塊呈分葉狀、質(zhì)實、邊界清、活動度可、無液化，28 d后腫塊增大伴中央液化。35 d后荷瘤裸大鼠的腫塊明顯增大伴有波動感，體質(zhì)量較同周齡鼠下降（10±2）%。8周后裸大鼠攝食、活動減少。

2.2 成瘤情況

A、B、C組的出瘤率分別為：52.3%、63.4%和100%，經(jīng)χ2檢驗顯示：A組與C組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而A組與B組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。上述結(jié)果說明組織塊比單細胞具有更好的成瘤性。

2.3 移植瘤的生長情況

C組的移植瘤生長速度快于A組和B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。并且組織塊形成的移植瘤大小均勻瘤體變異較小（圖1）。

2.4 裸大鼠皮下瘤病理學(xué)表現(xiàn)

圖1 移植瘤生長曲線

2.4.1 肉眼觀14 d時皮下腫瘤直徑10～12 mm，外觀呈分葉狀，色淡紅，與宿主組織界限清晰。腫瘤表面光滑，包膜完整，質(zhì)地中等。21 d后腫瘤進行性增大，剖面組織色灰白，似干酪樣改變。

2.4.2 鏡下觀腫瘤細胞排列紊亂，細胞核異形明顯，核質(zhì)比例增大，染色質(zhì)深且粗，核大深染，異常核分裂相易見（圖2）。

2.5 移植瘤細胞周期的變化

圖2 移植瘤大體和組織病理觀察

移植瘤細胞周期的變化見圖3。系碘化丙啶染色流式細胞儀分析的細胞周期結(jié)果，與初次培養(yǎng)細胞成瘤組比較二次懸浮細胞成瘤組和二次組織塊成瘤組的細胞主要分布在S和G2/M期。圖3顯示它們的細胞增殖指數(shù)分別為：（32.31±8.72）%、（47.68±4.72）%和（48.61±5.06）%，統(tǒng)計學(xué)分析顯示初次培養(yǎng)細胞成瘤組的增殖指數(shù)與二次懸浮細胞成瘤組和二次組織塊成瘤組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而二次懸浮細胞成瘤組與二次組織塊成瘤組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。細胞周期分析的結(jié)果表明了移植瘤內(nèi)的細胞增殖快于培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞，提示腫瘤細胞分裂活躍。

圖3 移植瘤細胞周期變化

3 討論

目前國內(nèi)學(xué)者研究人類肺癌的基礎(chǔ)研究多選用裸小鼠，但裸小鼠是一種缺乏胸腺、有免疫缺陷的嚙齒類動物［7-8］。為了彌補裸小鼠模型因個體小而不易評價涉及血管等介入操作的藥物評價缺陷，我們選擇與裸小鼠有類似免疫缺陷的裸大鼠來建立肺癌移植瘤模型。1977年英國MRC實驗動物中心建立了裸大鼠種群，上海中山醫(yī)院肝癌研究所早在1983年就引進該鼠種進行肝臟腫瘤的研究，此后國內(nèi)又有裸大鼠腸道腫瘤研究的報道。但由于裸大鼠較難飼養(yǎng)且研究成本較高［9-10］，國內(nèi)對其關(guān)注較少，有關(guān)裸大鼠人肺癌A549細胞株的皮下瘤的研究鮮見報道。

本研究采用人肺癌細胞株A549，選用裸大鼠作為研究對象，將肺癌細胞株移植于裸大鼠皮下，觀察其成瘤率，以便為肺癌介入治療方面的基礎(chǔ)實驗研究提供理想的動物移植性肺癌模型，這樣可使一群動物同時接種同樣量的瘤細胞或組織，生長速率比較一致，個體差異較小，接種成活率高，實驗條件易于控制，周期較短，易于客觀判斷療效［11］。我們發(fā)現(xiàn)8～10周齡裸大鼠體積較大，對頸外動脈解剖，沒有顯微鏡輔助，也能插管操作，為進一步血管介入治療的動物實驗研究提供了方便［12］。

本研究發(fā)現(xiàn)，荷瘤裸小鼠皮下移植瘤生長2周時行組織塊成瘤法裸大鼠皮下移植，成瘤率可達100%。這與此時皮下腫瘤細胞生長活躍有關(guān)，形成的腫瘤組織不僅在形態(tài)上而且在生物學(xué)行為上更適宜移植［13］。選取瘤塊時應(yīng)以近包膜的腫瘤組織為宜，避免選用腫瘤中央活性差的組織。因為惡性腫瘤生長較快，腫瘤中央組織常伴出血、壞死、纖維化或液化，而包膜處的瘤組織多含增殖活躍的腫瘤細胞。在對以裸大鼠為載體的人類肺癌移植瘤模型的研究過程中，我們總結(jié)了裸大鼠相對于裸小鼠作為動物腫瘤模型的優(yōu)點：①1只接近性成熟期的裸大鼠體重是裸小鼠體質(zhì)量的3～4倍，成年后體質(zhì)量可相差10～12倍。因此在解剖、暴露動物內(nèi)臟和血管介入等手術(shù)操作時體積大的裸大鼠比體積小的裸小鼠有優(yōu)勢；②移植性肺癌模型腫瘤生長快，成功率高，為需大量腫瘤組織的基礎(chǔ)研究提供了便利；③1只裸大鼠可獲得6～10 m l血液［14］，通過股動脈采血也可獲得1～2 ml血液，且不影響生存；而1只裸小鼠只能獲得1～2m l血液。因此，應(yīng)用裸大鼠人癌模型可同時檢測生化免疫指標并觀察各種指標的動態(tài)變化。

目前裸大鼠移植瘤模型多采用原位移植和皮下接種2種途徑［15］，但行裸大鼠原位移植難度大、不易成功且營養(yǎng)血管較細，無法完成血管插管介入治療。而皮下接種操作簡單，創(chuàng)傷小，腫瘤表淺易于觀察，所以我們選擇皮下接種的方法，但很多腫瘤的異種移植成功率低，往往阻礙了后繼實驗的進行［16］。本研究采用的3種方法成瘤率分別是52.3%、63.4%和100%。C組接種成功率達100%，該方法較簡單、經(jīng)濟，直視下接種部位準確，種植2～3周，腫瘤體積可利于血管介入評價的實施。模型制作［9，17-18］時應(yīng)注意以下幾點：①接種部位選擇裸大鼠耳后皮下，因該部位腫瘤生長速度快，不影響大鼠日?；顒?，且有利于目測腫瘤生長速度；②行組織病理檢查時取腫瘤魚肉樣組織，剝離后盡可能沖洗干凈血液、將壞死組織及纖維組織剔除干凈；③組織塊不可過大或過小，進針深度要保證接種于皮下，而不是皮內(nèi)或者肌肉組織內(nèi)；④注意無菌操作，避免感染所致接種失敗。實驗結(jié)果證明二次組織塊成瘤率高達100%，顯著提高了肺癌A549裸大鼠移植瘤的成功率，考慮與腫瘤組織塊中穩(wěn)態(tài)微環(huán)境分泌的細胞和生長因子保護并支持著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［19］。C組中腫瘤組織塊中穩(wěn)態(tài)微環(huán)境的形成可能是其具有較好的成瘤性和增殖能力的主要原因。

肺癌的介入治療是目前治療不可切除性肺癌的有效方法之一，它能直接進入靶血管提高局部抗腫瘤藥物的濃度，明顯提高抗腫瘤藥物的療效［20］。在這樣理想和標準的應(yīng)用裸大鼠肺癌動物模型上嘗試各種介入治療方案并相互比較療效是非常有益的。本實驗結(jié)果表明A549細胞株能在裸大鼠皮下建立可靠的肺癌移植瘤的模型，由于裸大鼠體型、器官、血管等都較裸小鼠大，更適用于人類腫瘤介入治療的實驗研究，具有操作簡便安全、可血管介入插管操作的特點，為后續(xù)進行的肺癌模型的介入治療提供了很好的實驗?zāi)Ｐ突A(chǔ)。

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Establishment of nude rat tumor xenograft m odel of hum an lung cancer cells A549：its clinical app lication

CAO Jun，HE Yang，LIU Hong-qiang，WANG Sai-bo，ZHAO Bao-cheng，ZHENG Xiao-hui， CHENG Ying-sheng.Medical College，Soochow University，Suzhou，Jiangsu Province 215123，China

CHENGYing-sheng，E-mail：chengyingsheng@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the method for effective establishment of nude rat tumor xenograftmodel of human lung cancer cells A549 in order to provide the experimental basis for tumor-related interventional research in vivo.MethodsA549 cell lines were subcutaneously transplanted in nude rats，then single-cell suspension or tumor tissue block were prepared when the tumor lesion was established.The single-cell suspension and tumor tissue block were transplanted into subcutaneous tissue behind ear in rats. The tumor formation rate，growth situation and cell cycle of primary xenograft tumor group，the secondary single-cell suspension group and the secondary tumor block group were evaluated.The resultswere analyzed. Results The tumor formation rate of the secondary tumor block group was significantly higher than that of the other two groups.The tumor cells quickly proliferated with less tumor variation.Tumor cell cycle analysis indicated thatG2/M ratio of the secondary tumor block group was remarkably higher than thatof the other two groups.ConclusionTransplantation with tumor tissue block can significantly increase the tumor formation rate of human lung cancer cells A549 in experimental rats.This technique is an effective method for the establishmentof nude rat tumor xenograftmodel.（J Intervent Radiol，2014，23：901-905）

A549 cell line；xenograft tumormodel；nude rat

R734.2

B

1008-794X（2014）-10-0901-05

2014-07-09）

（本文編輯：李欣）

10.3969／j.issn.1008-794X.2014.10.016

上海市自然科學(xué)基金（12ZR1428900）；上海市衛(wèi)生計生委科研項目（20114344）；上海市衛(wèi)生計生委青年科研項目（20124Y096）

215123蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部［曹軍（現(xiàn)在上海市徐匯區(qū)大華醫(yī)院，200237）］；上海市徐匯區(qū)大華醫(yī)院（何陽、劉洪強、王賽博、趙保成、鄭曉輝）；上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院（程英升）

程英升E-mail：chengyingsheng@hotmail.com