2種灌木柳葉片細(xì)胞膜相穩(wěn)定性及抗氧化酶活性對NaCl脅迫的響應(yīng)

周 鵬，方炎明，孫 婷，王保松，張 敏*

（1.南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153）

2種灌木柳葉片細(xì)胞膜相穩(wěn)定性及抗氧化酶活性對NaCl脅迫的響應(yīng)

周 鵬1，方炎明1，孫 婷1，王保松2，張 敏2*

（1.南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153）

以2個灌木柳無性系（耐鹽型JW2345，鹽敏感型SW2367）為試驗材料，水培法培養(yǎng)幼苗，鹽脅迫（NaCl濃度分別為0，50，100和200 mmol／L）處理幼苗12 d，研究鹽脅迫對柳樹生長、葉片細(xì)胞膜相穩(wěn)定性及抗氧化酶活性的影響。結(jié)果顯示：NaCl脅迫抑制了灌木柳幼苗的生長，JW2345受抑制程度明顯小于JW2367；在100 mmol／L NaCl處理下，隨著NaCl脅迫時間的延長，其細(xì)胞膜相穩(wěn)定性下降，MDA含量增加，但無性系不同，變化幅度不同。葉片CAT活性均先升高后下降，SOD和POD活性變化規(guī)律顯著不同，JW2345中SOD和POD均顯著高于對照，且隨處理時間的延長呈升高趨勢；短期脅迫對JW2367的SOD活性無影響，長期脅迫誘導(dǎo)其顯著上升，而POD活性先增加后降低。研究認(rèn)為：NaCl脅迫抑制灌木柳幼苗的生長，破壞膜相穩(wěn)定性。耐鹽性較強的JW2345受破壞程度較低，這可能與其維持抗氧化系統(tǒng)平衡密切相關(guān)，其中SOD、POD起關(guān)鍵作用。

灌木柳；細(xì)胞膜穩(wěn)定性；丙二醛；抗氧化酶系統(tǒng)

細(xì)胞膜是外界鹽離子進入細(xì)胞的第一道屏障，膜系統(tǒng)的完整性與植物耐鹽性呈正相關(guān)。當(dāng)植物受到NaCl脅迫時，細(xì)胞膜相的結(jié)構(gòu)和功能受到傷害，膜穩(wěn)定性降低，植物的正常代謝受到影響［1］。鹽脅迫下，植物細(xì)胞膜系統(tǒng)的變化包括鹽分對膜相的破壞和植物對膜系統(tǒng)的保護2個方面。研究表明，由活性氧（ROS）引起的膜脂過氧化是引起膜傷害的重要原因，膜系統(tǒng)的保護則與植物活性氧代謝平衡密切相關(guān)［2－4］。

柳樹屬楊柳科柳屬（Salix L.），種類多，抗性強［5］，其中一些品種具有較強的耐鹽性［6－7］。目前，有關(guān)柳樹抗鹽性研究已有初步報道［8］，而作為鹽脅迫原初傷害之一的膜損傷機制研究尚未見到相關(guān)報道。本試驗采用水培方法，以2個不同耐鹽性灌木柳無性系為材料，比較NaCl脅迫下葉片細(xì)胞膜相穩(wěn)定性及抗氧化保護酶的變化規(guī)律，探討鹽脅迫下膜穩(wěn)定性和抗氧化保護酶活性與耐鹽性的關(guān)系，以期為灌木柳耐鹽機理研究及選育耐鹽品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為2個灌木柳雜交種無性系：鹽耐受型JW2345（Salix suchowensis×S．integra）和鹽敏感型JW2367（S．viminalis×S．a(chǎn)rgyracea）。

1.2 方法

1.2.1 組織培養(yǎng)生根苗 選取灌木柳枝條水培后新長出的嫩莖作為外植體，建立組織培養(yǎng)無性系。增殖培養(yǎng)基為WPM＋0.6 mg／L 6-BA＋0.05 mg／L NAA＋500 mg／L酸水解酪蛋白＋1 g／L活性炭，pH 5.8，溫度（26±2）℃，光強2 000 lx，光周期16／8 h，繼代周期25 d。獲得足夠數(shù)量生長穩(wěn)定的健壯生根苗。

1.2.2 鹽脅迫處理 NaCl處理參照張敏等［9］的方法，選取株高一致、根系發(fā)達(dá)、生長健壯的組培生根苗，移入塑料套盆中，用NaCl溶液處理，每盆50株。NaCl溶液用1／2 MS液體培養(yǎng)基配制，用量為每盆500 mL，每2 d更換1次培養(yǎng)液。NaCl溶液濃度為0（CK），50，100和200 mmol／L，每個處理重復(fù)3次，處理6 d和12 d后取樣備測。

1.2.3 生長指標(biāo)測定 處理12 d后，每個處理組隨機取35株幼苗測定植株生物量，每處理重復(fù)3次。用蒸餾水沖洗根系，并用吸水紙吸干植株表面水分，放入烘箱，105℃殺青15 min，75℃烘干至恒重，稱重。

1.2.4 細(xì)胞膜穩(wěn)定指數(shù)測定 分別于NaCl處理6，12 d后，取葉片用去離子水沖洗，然后將表面水吸干，稱取相同質(zhì)量葉片，置于盛有25 mL去離子水的具塞試管中，40℃靜置30 min后，測定電導(dǎo)率（L1）；然后將試管置于100℃水浴30 min，冷卻至室溫后測定電導(dǎo)率（L2）。參照Bhutta［2］的方法，計算細(xì)胞膜穩(wěn)定指數(shù)（MSI）：MSI＝（1－L1／L2）× 100%。每個處理重復(fù)3個。

1.2.5 MDA含量測定 MDA含量測定參考Agrawal等［10］的方法，略有改動。稱取0.5 g葉片，加入5 mL 0.1%的三氯乙酸（TCA），勻漿后15 000×g離心5 min，上清液即為樣品提取液。取1 mL上清液，加入4 mL 0.5%的TBA。混合液95℃水浴30 min后，立刻冰浴冷卻，10 000×g離心10 min。上清液分別于532 nm和600 nm波長下測定吸光度。

1.2.6 抗氧化酶活性測定

（1）粗酶液制備。稱取1 g植物葉片置于研缽中，加入5 mL 50 mmol／L PBS（含1 mmol／L EDTA和1%PVPP，pH 7.0），冰浴下勻漿，13 000×g，4℃離心20 min。上清液即酶液，－20℃保存?zhèn)錅y。

（2）酶活性和可溶性蛋白含量測定?？寡趸富钚院涂扇苄缘鞍缀繙y定采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進行。

1.3 統(tǒng)計分析方法

采用Excel 2003及SPSS 13.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NaCl脅迫對灌木柳生物量的影響

結(jié)果見圖1。由圖1可知，處理12 d后，低濃度鹽脅迫（50 mmol／L NaCl）下，灌木柳水培苗干質(zhì)量與對照無顯著差異（P＞0.05）；100 mmol／L NaCl處理后，2個無性系干質(zhì)量相對于對照均出現(xiàn)顯著性差異，且JW2367下降幅度顯著大于JW2345（P＜0.05）；200 mmol／L NaCl脅迫下，JW2345干質(zhì)量降低幅度進一步增大，而JW2367植株幾乎全部萎蔫，此濃度已為JW2367的致死濃度?？梢姡}脅迫顯著抑制了灌木柳幼苗的生長，且對JW2367生長的抑制作用明顯大于JW2345。據(jù)此，在下面進行的灌木柳耐鹽機理研究中選擇NaCl處理濃度為100 mmol／L。

圖1 不同濃度鹽脅迫對灌木柳無性系植株干質(zhì)量的影響

2.2 NaCl脅迫對灌木柳葉片質(zhì)膜穩(wěn)定性的影響

植物細(xì)胞膜穩(wěn)定性可通過細(xì)胞膜穩(wěn)定指數(shù)（MSI）來表示。如圖2，在100 mmol／L NaCl脅迫下，2個無性系MSI隨脅迫時間延長的變化存在顯著差異。短期鹽脅迫（6 d）對JW2345幼苗MSI值無顯著影響（P＞0.05），NaCl處理12 d時MSI值開始顯著低于對照，為對照的93.96%。鹽脅迫下，JW2367幼苗MSI值顯著低于對照，且降低幅度隨脅迫時間的延長而增大，12 d時比對照降低15.38%。在相同處理濃度和脅迫時間下，JW2345 MSI均顯著高于JW2367。

圖2 不同濃度鹽脅迫對灌木柳無性系葉片MSI的影響

2.3 NaCl脅迫對灌木柳葉片膜脂過氧化作用的影響

MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，是衡量膜系統(tǒng)傷害程度的重要指標(biāo)之一［11］。從圖3可以看出，JW2345葉片MDA含量變化趨勢基本與MSI值的變化趨勢相反，且相同處理濃度和脅迫時間下，JW2345 MDA含量均低于JW2367。鹽脅迫6 d時，JW2345葉片MDA含量與對照差異不顯著（P＞0.05），12 d時顯著高于對照，為對照的1.34倍。NaCl脅迫顯著提高JW2367 MDA含量，6，12 d時 MDA含量分別為對照的1.43倍和1.49倍，但12 d時與6 d時無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 不同濃度鹽脅迫對灌木柳無性系葉片MDA含量的影響

2.4 NaCl脅迫對灌木柳葉片抗氧化酶活性的影響

2.4.1 NaCl脅迫對灌木柳SOD活性的影響 由圖4可見，在100 mmol／L NaCl脅迫下，JW2345葉片中SOD活性隨著鹽脅迫時間的延長，呈上升趨勢，在鹽脅迫6，12 d時分別比對照升高24.29%，54.47%，且差異顯著；鹽脅迫6 d時，JW2367葉片中SOD活性與對照無顯著變化（P＞0.05），脅迫12 d時，顯著高于對照，為對照的1.29倍。

圖4 不同濃度鹽脅迫對灌木柳無性系葉片SOD活性的影響

2.4.2 NaCl脅迫對灌木柳POD活性的影響 100 mmol／L NaCl濃度下，2個無性系POD活性均顯著高于對照（見圖5）。其中，JW2345葉片中POD活性隨著鹽脅迫時間的延長，呈上升趨勢，在鹽脅迫6 d和12 d時分別比對照升高24.66%和34.70%（P＜0.05）；JW2367葉片中POD活性隨鹽處理時間延長，先上升后下降，其在脅迫6 d和12 d時的活性分別為對照的1.21倍和1.14倍。

2.4.3 NaCl脅迫對灌木柳CAT活性的影響 從圖6可以看出，在100 mmol／L NaCl濃度下，隨著鹽脅迫時間的延長，灌木柳幼苗CAT活性變化基本一致，脅迫前期CAT活性顯著高于對照（P＜0.05），之后又迅速下降，12 d時JW2345仍高于對照，而JW2367已低于對照水平，但與對照的差異均不顯著（P＞0.05）。

圖5 不同濃度鹽脅迫對灌木柳無性系葉片POD活性的影響

圖6 不同濃度鹽脅迫對灌木柳無性系葉片CAT活性的影響

3 結(jié)論與討論

生物量是植物對鹽脅迫反應(yīng)的綜合體現(xiàn)，也是評價植物耐鹽性的重要指標(biāo)［12－13］。本試驗中，低鹽脅迫（50 mmol／L NaCl）對灌木柳幼苗生長沒有明顯影響；中、高鹽脅迫（100～200 mmol／L NaCl）則抑制了2個無性系幼苗的生長，且JW2367生長受抑制程度明顯大于JW2345。說明2個無性系的耐鹽性存在明顯差異，JW2345植株的耐鹽性較強。

本試驗中，鹽耐受型灌木柳JW2345葉片MSI值始終高于鹽敏感型JW2367，且線性相關(guān)分析顯示，干質(zhì)量與MSI存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系（r＝0.997，P＜0.01）。說明耐鹽型JW2345能維持較高的質(zhì)膜穩(wěn)定性水平，可能是其對鹽脅迫耐受性較鹽敏感型JW2367強的原因之一［14］。根據(jù)自由基理論［15］，植物逆境傷害是由于活性氧代謝平衡失調(diào)所致。本研究結(jié)果表明，MDA含量與MSI值呈極顯著負(fù)相關(guān)（r＝－0.865，P＜0.01），鹽敏感型JW2367葉片MDA含量顯著高于耐鹽型JW2345。此外，脅迫后期JW2367 MSI值顯著降低，而MDA含量變化不大，這可能是由于質(zhì)膜嚴(yán)重破壞，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流失導(dǎo)致。以上結(jié)果說明，鹽脅迫下鹽敏感型JW2367葉片中由于活性氧代謝平衡失調(diào)，膜脂發(fā)生過氧化，導(dǎo)致膜穩(wěn)定性下降［16］。

超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）是參與活性氧代謝的重要酶類，SOD通過歧化反應(yīng)催化O·2生成H2O2，H2O2必須進一步被CAT和各種過氧化物酶所清除，3者協(xié)同作用，在維持植物體內(nèi)活性氧的動態(tài)平衡方面起著極其重要的作用［17－18］。在100 mmol／L NaCl處理下，脅迫前期JW2345通過誘導(dǎo)提高自身各類保護酶活性，維持活性氧代謝平衡；脅迫后期，SOD、POD活性顯著上升，CAT活性有所下降。研究表明，POD對H2O2清除親和性顯著高于CAT［3，19］，此時植物可能通過進一步提高POD等過氧化物酶的活性，補償自身清除H2O2的能力，調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)內(nèi)部平衡，減輕膜脂過氧化。鹽脅迫下JW2367葉片中抗氧化保護酶內(nèi)部間平衡嚴(yán)重失調(diào)，脅迫前期POD、CAT顯著高于對照，SOD與對照差異不顯著，細(xì)胞內(nèi)大量積累O·2；后期SOD上升，POD和CAT下降，此時H2O2積累，可能轉(zhuǎn)變?yōu)槠茐男宰顝姷摹H［20］，導(dǎo)致質(zhì)膜穩(wěn)定性喪失。因此，在一定的鹽脅迫下，抗氧化系統(tǒng)平衡情況可作為耐鹽性鑒定的指標(biāo)，在維持膜系統(tǒng)穩(wěn)定性方面POD可能比SOD占更重要的地位，而CAT在鹽脅迫中的抗氧化作用不明顯，這與Sergio等［21］研究菊苣（Cichorium intybus L.）耐鹽性時所得結(jié)論一致。

植物耐鹽性與鹽逆境下的質(zhì)膜穩(wěn)定性顯著相關(guān)，質(zhì)膜穩(wěn)定性又與鹽脅迫下植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)平衡情況緊密相關(guān)。SOD和POD在維持灌木柳活性氧代謝平衡，保證細(xì)胞膜穩(wěn)定性過程中起著關(guān)鍵作用，但抗氧化酶種類較多，尤其是POD，究竟哪類保護酶在維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性上起主要作用以及保護酶之間的相互作用如何，還有待進一步研究。

［1］ Hajlaoui H，Denden M，El Ayeb N.Changes in fatty acids composition，hydrogen peroxide generation and lipid peroxidation of salt－stressed corn（Zea maysL.）roots［J］.Acta Physiologiae Plantarum，2009，31（4）：787-796.

［2］ Bhutta W M.Antioxidant activity of enzymatic system of two different wheat（Triticum aestivumL.）cultivars growing under salt stress［J］.Plant，Soil and Environment，2011，57（3）：101-107.

［3］ Bor M，Ozdemir F，Turkan I.The effect of salt stress on lipid peroxidation and antioxidants in leaves of sugar beetBeta vulgarisL. and wild beetBeta maritimaL.［J］.Plant Science.2003，164（1）：77-84.

［4］ Duan J J，Li J，Guo S R，et al.Exogenous spermidine affects polyamine metabolism in salinity-stressedCucumis sativusroots and enhances short-term salinity tolerance［J］.Journal of Plant Physiology，2008，165（15）：1620-1635.

［5］ 汪有良，王寶松，施士爭.灌木型柳樹鎘吸收積累性狀的研究［J］.西北林學(xué)院學(xué)報，2011，26（2）：105-110.

［6］ Hangs R D，Schoenau J J，Van Rees K C J，et al.Examining the salt tolerance of willow（Salixspp.）bioenergy species for use on salt-affected agricultural lands［J］.Canadian Journal of Plant Science，2011，91（3）：509-517.

［7］ Zhou J，Liu M Y，Jiang J，et al.Expression profile of miRNAs inPopulus cathayanaL.andSalix matsudanaKoidz under salt stress［J］.Molecular Biology Reports，2012，39（9）：8645-8654.

［8］ 施士爭，隋德宗，王紅玲，等.灌木柳速生無性系的耐鹽性選擇研究［J］.西北林學(xué)院學(xué)報，2010，25（4）：72-77.

［9］ 張 敏，李榮錦，黃利斌，等.NaCl脅迫下構(gòu)樹幼苗液泡膜生理生化響應(yīng)［J］.林業(yè)科學(xué)，2009，45（8）：50-55.

［10］Agrawal R，Gupta S，Gupta N K，et al.Effect of sodium chloride on gas exchange，antioxidative defense mechanism and ion accumulation in different cultivars of Indian jujube（Ziziphus mauritianaL.）［J］.Photosynthetica，2013，51（1）：95-101.

［11］Koca H，Bor M，Ozdemir F，et al.The effect of salt stress on lipid peroxidation，antioxidative enzymes and proline content of sesame cultivars［J］.Environmental and Experimental Botany，2007， 60（3）：344-351.

［12］Wani A S，Ahmad A，Hayat S，et al.Salt-induced modulation in growth，photosynthesis and antioxidant system in two varieties ofBrassica juncea［J］.Saudi Journal of Biological Sciences，2013，20（2）：183-193.

［13］Bavei V，Shiran B，Arzani A.Evaluation of salinity tolerance in sorghum（Sorghum bicolorL.）using ion accumulation，proline and peroxidase criteria［J］.Plant Growth Regulation，2011，64（3）：275-285.

［14］Sairam R K，Srivastava G C，Agarwal S，et al.Differences in antioxidant activity in response to salinity stress in tolerant and susceptible wheat genotypes［J］.Biologia Plantarum，2005，49（1）：85-91.

［15］Karihtala P，Soini Y.Reactive oxygen species and antioxidant mechanisms in human tissues and their relation to malignancies［J］.APMIS，2007，115（2）：81-103.

［16］Demiral T，Turkan I.Comparative lipid peroxidation，antioxidant defense systems and proline content in roots of two rice cultivars differing in salt tolerance［J］.Environmental and Experimental Botany，2005，53（3）：247-257.

［17］Dolatabadian A，Sanavy S，Chashmi N A.The effects of foliar application of ascorbic acid（Vitamin C）on antioxidant enzymes activities，lipid peroxidation and proline accumulation of canola（Brassica napusL.）under conditions of salt stress［J］.Journal of Agronomy and Crop Science，2008，194（3）：206-213.

［18］Rasool S，Ahmad A，Siddiqi T O，et al.Changes in growth，lipid peroxidation and some key antioxidant enzymes in chickpea genotypes under salt stress［J］.Acta Physiologiae Plantarum，2013，35（4）：1039-1050.

［19］Nawaz K，Ashraf M.Exogenous application of glycinebetaine modulates activities of antioxidants in maize plants subjected to salt stress［J］.Journal of Agronomy and Crop Science，2010，196（1）：28-37.

［20］班兆軍，關(guān)軍鋒，李 莉，等.非生物脅迫下植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和抗氧化機制的研究概述［J］.中國果菜，2012（5）：40-47.

［21］Sergio L，De Paola A，Cantore V，et al.Effect of salt stress on growth parameters，enzymatic antioxidant system，and lipid peroxidation in wild chicory（Cichorium intybusL.）［J］.Acta Physiologiae Plantarum，2012，34（6）：2349-2358.

Membrane stability and antioxidant enzyme activity in the leaves of two clones of shrub willow in response to salinity stress

ZHOU Peng1，F(xiàn)ANG Yan-ming1，SUN Ting1，WANG Bao-song2，ZHANG Min2*
（1.College of Forest Resources and Environment，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China；2.Jiangsu Academy of Forestry，Nanjing 211153，China）

Differential response of two clones of shrub willow，namely，salt-tolerant clone JW2345 and salt-sensitive clone JW2367，to salinity stress in relation to membrane stability and antioxidant enzyme activity were evaluated.The plantlets were treated with NaCl solution at 0，50，100，or 200 mmol／L for 12 days.The results showed that the growth of shrub willow plantlets was inhibited，and the extent of inhibition for Clone JW2345 was less than that for Clone JW2367.Under 100 mmol／L NaCl stress，the membrane stability decreased with the stress time duration while the contents of MDA increased. Moreover，the degree of variation in different clones was different.CAT activities increased at the sixth day and decreased at the twelfth day in both clones.In the leaves of Clone JW2345，NaCl treatment elevated the activities of SOD and POD，and the enzymatic activities increased with the treatment time duration.In contrast，there was no obvious alteration in SOD activities in Clone JW2367 at the sixth day，however，the activities increased dramatically at the twelfth day.POD activities increased sharply at the sixth day，and then the activities declined after the treatment with NaCl for 12 days.Altogether，these results suggested that the growth of shrub willow was inhibited by salinity stress，and the membrane stability was destroyed.Furthermore，the membrane stability of the salt－tolerant clone JW2345

less attack，which might be attributed to the maintenance of the balance of antioxidant system，among which SOD and POD played a critic role.

Shrub willow；Membrane stability；MDA；Antioxidant enzymes

S792.12

A

10.3969／j.issn.1001－7380.2014.02.001

1001－7380（2014）02－0001－05

2014-03-10；

2014-03-14

國家自然科學(xué)基金“NaCl脅迫下一氧化氮調(diào)控灌木柳液泡膜H＋－ATPase的分子機制”（31300515）；江蘇省自然科學(xué)基金“柳樹H＋－ATPase響應(yīng)NaCl脅迫的分子機制”（BK2011872）

周 鵬（1989－），男，碩士研究生，主要從事植物生理生化研究。

*通信作者：張 敏（1980－），女，內(nèi)蒙古人，副研究員，博士，主要從事植物抗逆生理及林木花卉良種繁育研究。