腹瀉癥候群致瀉性大腸埃希氏菌血清型及毒力基因檢測(cè)

慕毅敏 蔡旭明 周敬綱 蔡旭輝

致瀉性大腸埃希菌生存與人和動(dòng)物的腸道中，隨糞便排出而污染水源、土壤、食品、器具等，人群對(duì)致瀉大腸埃希菌普遍易感，根據(jù)其致病機(jī)制，致瀉大腸埃希菌至少可分為5個(gè)類型：腸產(chǎn)毒素大腸埃希菌（ETEC）、腸致病性大腸埃希菌（EPEC）、腸侵襲性大腸埃希菌（EIEC）、腸出血性大腸埃希菌（EHEC）、腸集聚性黏附性大腸埃希菌（EAEC）。其中，ETEC是發(fā)展中國(guó)家嬰幼兒及旅游者腹瀉的主要病原，EPEC是嬰兒腹瀉的主要病原，EIEC主要引起較大兒童和成人腹瀉[1-2]。為了全面了解本地區(qū)腹瀉癥候群中致瀉大腸埃希菌的感染情況，查清致瀉大腸埃希菌的血清群、型分布規(guī)律以及所攜帶毒力基因[3-6]，為腹瀉病的防治對(duì)策提供科學(xué)依據(jù)[7-8]，現(xiàn)將2012-2013年本地區(qū)腹瀉癥候群中致瀉大腸埃希菌的監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)情況報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 本地區(qū)2012-2013年腹瀉癥候群監(jiān)測(cè)醫(yī)院門診未使用過(guò)抗生素腹瀉患者的稀便、水樣便、黏膿便或膿血便等。標(biāo)本總計(jì)719份，其中7歲以下嬰幼兒618份，7歲以上兒童及成人101份。

1.2 標(biāo)本的分離程序

1.2.1 分離 用無(wú)菌拭子采集少量糞便直接接種麥康凱（MAC）瓊脂平板和O157顯色平板上，溫度（36±1）℃，培養(yǎng)18~24 h。

1.2.2 增菌 用無(wú)菌拭子采集少量糞便接種mEC肉湯增菌液，（36±1）℃，培養(yǎng)6 h后，取1 mL用O157免疫磁珠進(jìn)行富集后，接種于O157顯色平板和MAC平板18~24 h。

1.2.3 挑取可疑菌落 挑取MAC瓊脂平板上發(fā)酵乳糖的桃紅色、不透明的可疑菌落或O157顯色平板上紫紅色或淡紫色、中等大小菌落進(jìn)行生化初篩實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 生化初篩 凡是TSI斜面產(chǎn)酸或不產(chǎn)酸、底層產(chǎn)酸、不產(chǎn)生H2S的菌株，進(jìn)行IMViC實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為++--或-+--，尿素-。

1.2.5 多重PCR 通過(guò)對(duì)主要致瀉大腸埃希菌目的基因多重PCR擴(kuò)增片段，判斷擴(kuò)增陽(yáng)性結(jié)果。

1.2.6 血清型鑒定 挑取經(jīng)PCR試驗(yàn)證實(shí)為致瀉性大腸埃希菌的純培養(yǎng)物，用相應(yīng)致瀉大腸O多價(jià)、O單價(jià)、K、H診斷血清進(jìn)行血清玻片凝集試驗(yàn)。

1.2.7 結(jié)果判定 綜合生化試驗(yàn)、多重PCR試驗(yàn)和血清型分型試驗(yàn)進(jìn)行鑒定和報(bào)告。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 本次檢測(cè)分離到血清凝集致瀉大腸埃希菌65株，占所檢標(biāo)本總數(shù)的9.04%（65/719），其中7歲以下嬰幼兒59株，7歲以上兒童及成人6株；而未分血清型致瀉大腸埃希菌27株，占檢測(cè)標(biāo)本的3.75%（27/719），其中7歲以下嬰幼兒24株，7歲以上兒童及成人3株；其中EPEC檢出率為10.15%（73/719），毒力基因檢測(cè)以escV為主，占8.90%（64/719）。

2.2 65株血清凝集致瀉性大腸埃希菌的血清分型 分離出的EPEC、EIEC、ETEC共分8種O血清型，其中EPEC分為6種不同血清型，主要血清型為O55：H59、O128：H67；EIEC和ETEC各分一種血清型，見(jiàn)表1。

表1 65株血清凝集致瀉性大腸埃希菌血清分型分布結(jié)果

2.3 65株血清分型凝集菌株毒力基因的分布情況 65株血清分型凝集菌株中，49株（75.38%）攜帶escV，5株（7.69%）攜帶escV+bfpB，7株（10.77%）攜帶invE，4株（6.16%）攜帶elt，見(jiàn)表2。

2.4 27株未分血清型致瀉性大腸埃希菌毒力基因分布結(jié)果 檢測(cè)出毒力基因共5種，分別為escV、escV+bfpB、invE、elt、astA，分屬EPEC、EIEC、ETEC、EAEC，見(jiàn)表3。

3 討論

大腸埃希菌感染全年均可發(fā)病，但大多發(fā)生于5-10月，其中7-9月是發(fā)病高峰。致瀉性大腸埃希菌生存于人和動(dòng)物的腸道中，人群普遍易感，引起急性胃炎、急性菌痢、出血性腸炎，傳播因素多種多樣，包括水、食品、日常生活用品、蒼蠅等，還可以通過(guò)接觸動(dòng)物或帶菌者傳播[1]。

本次檢測(cè)分離到血清凝集致瀉大腸埃希菌65株，占所檢標(biāo)本總數(shù)的9.04%（65/719），而未分血清型致瀉大腸埃希菌27株，占檢測(cè)標(biāo)本的3.75%（27/719）；其中EPEC檢出率為10.15%（73/719），與國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道基本符合[2-3]，毒力基因檢測(cè)以escV為主，占8.90%（64/719）；其余毒力基因escV+bfpB、invE、elt、astA與相關(guān)報(bào)道基本一致[4-5]。

在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室，致瀉性大腸埃希菌（DEC）常規(guī)測(cè)定只能鑒定DEC的表型特征，然而，這些方法在鑒定5種具體的DEC是不夠的[9-11]。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)于腹瀉患者的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)主要是分離糞便標(biāo)本中的腹瀉病原菌，然而，由于大多數(shù)患者發(fā)病后很快使用抗生素，而使細(xì)菌的分離培養(yǎng)結(jié)果不理想。因此，傳統(tǒng)的糞便細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)方法已不能滿足診斷的要求，在我國(guó)大多數(shù)微生物實(shí)驗(yàn)室，如果從腸道分離的菌株不與ETEC、EPEC、EIEC、EHEC、EAEC這5種大腸埃希菌的診斷血清發(fā)生凝集，就判斷為腸道正常大腸埃希菌。這樣做往往會(huì)失掉大部分病原菌的檢出率[12-15]。近年來(lái)，多重PCR作為一種不依賴于細(xì)菌培養(yǎng)，適合于在細(xì)菌種群多樣性體系中快速篩查疑似病原菌的新技術(shù)而廣泛應(yīng)用，此方法檢測(cè)毒力基因更快速，敏感性高，特異性強(qiáng)[16-20]。

表2 65株血清分型菌株毒力基因分布

表3 27株未分血清型致瀉性大腸埃希菌毒力基因分布 株（%）

因此，在腹瀉患者的大腸埃希菌檢測(cè)中，在傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、血清學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，有必要進(jìn)行大腸埃希菌的毒力基因檢測(cè)，以提高陽(yáng)性檢出率，避免漏檢，提高致瀉性大腸埃希菌的診斷。

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