復方中藥對免疫抑制小鼠免疫促進作用的研究

屈新輝 劉春發(fā) 胡建新 何 丹 項正兵 吳曉牧

1.江西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江西南昌 330006；2.江西省神經(jīng)病學研究所，江西南昌 330006；3.南昌大學醫(yī)學院，江西南昌 330006；4.江西省人民醫(yī)院藥劑科，江西南昌 330006

免疫學是現(xiàn)代醫(yī)學發(fā)展極為迅速的學科之一，疾病發(fā)生發(fā)展很多都與免疫功能有關(guān)，某些腫瘤患者在放療、化療后或一些病毒感染后致免疫性力低下，但臨床增強免疫力有明顯臨床療效的藥物卻不多見。祖國醫(yī)學認為“正虛邪擾”，疾病與人體的抵抗力密切相關(guān)，并且臨床處方運用扶正祛邪的法則治療疾病，臨床觀察亦有療效，許多學者研究了多種單味藥對免疫功能的調(diào)節(jié)作用，嘗試發(fā)現(xiàn)、提取、合成能調(diào)節(jié)免疫的化合物，本實驗旨在從細胞及分子水平出發(fā)，探求中藥復方對免疫功能增強的作用及效能，在扶正固本、活血益氣的中藥中遴選出有廣闊應用前景的促進免疫的中藥復方。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥的制備

復方中藥（由西洋參、黃芪、枸杞、當歸等多味藥）組成，按總量400 g（西洋參96 g、黃芪96 g、枸杞128 g、當歸80 g）稱取處方各藥（由江西省人民醫(yī)院藥劑科供應），加蒸餾水400 mL，浸泡24 h，隔水煮1 h，濾過藥液，藥渣再加蒸餾水適量，煮1 h，濾出藥液，合并兩次藥液，隔水濃縮至400 mL，即每1 mL相當于1 g生藥的原液，滅菌封存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 實驗動物

6 周齡昆明小鼠 50 只，體重（20±2）g，雌雄各半，均購自江西中醫(yī)學院。動物自由飲食、飲水，動物質(zhì)量合格證號：JIDW NO.2012-0041。試驗過程中對動物的處置符合2006年科技部關(guān)于對試驗動物的有關(guān)規(guī)定[1]。

1.1.3 試劑與儀器

免疫抑制劑環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：12030625），為 200 mg/支的粉針劑；小鼠IgG和補體C3的ELISA檢測試劑盒為西唐生物公司進口分裝產(chǎn)品（批號分別為：1208061、1208201）；Anti-MouseCD3（PE-Cy5）、Anti-MouseCD4（FITC）、Anti-Mouse CD8 （PE）、Anti-Mouse CD19 （PE）、Anti-MouseCD49（FITC）、Anti-MouseIL-2（PE）、Anti-MouseIFN-γ（FITC）熒光抗體 （購于eBioscience Inc.San Diego，CA公司，批 號 分 別 為 E06065-1630、E00077-1630、E01036-1633、E01047-1630、E00752-1630、E02060-1630、E00862-1631）；BECKMAN COULTER流式細胞儀；酶標儀（550 型）；倒置顯微鏡（Leica）；光學顯微鏡（OLYMPUS）；紅細胞裂解液（實驗室制自備）；PBS緩沖液（實驗室制自備）；16號小鼠灌胃針；Allegra 64R低速冷凍離心機 （BECKMAN COULTER，rmax=204 mm）；HC電子天平（0.1 g）、sarrorious 電子天平（0.001 g），300目金屬篩網(wǎng)。

1.2 方法

1.2.1 藥物急性毒理試驗

該復方中藥各組份臨床應用廣泛，未見明顯毒副作用，因此用小鼠灌胃最大容量0.4 mL/10 g[2]來檢查藥物的LD50，取20只小鼠，每次灌胃復方中藥0.8 mL，2次/d，觀察 15 d，無一死亡，可見 LD50＞ 0.4 mL/10 g。

1.2.2 實驗分組

應用隨機數(shù)字表法進行隨機將動物分為5組：正常對照組、模型對照組、低劑量中藥組、中劑量中藥組、高劑量中藥組。每組10只，雌雄各半。將需隨機分組的雌雄性小鼠分別稱重，按序編號記錄體重結(jié)果，給每只小鼠鼠分配一個隨機數(shù)，按隨機數(shù)字大小升序排序，按排序后的順序依次將小鼠分入各個劑量組 。各組體重均值再做F檢驗（單因素方差分析），需滿足P＞0．05，如果條件不能滿足，則重復以上過程，直到滿足為止。隨機分組結(jié)束后，分別按各組的原始編號編上實驗編號。

1.2.3 小鼠免疫抑制模型

建立小鼠免疫抑制模型一次性腹腔注射環(huán)磷酰胺200 mg/kg，造模完成[3]，正常對照組注射環(huán)磷酰胺溶劑生理鹽水4 mL/kg。

1.2.4 給藥方法

中藥治療組于環(huán)磷酰胺造模后第2天開始用中藥按小鼠體重灌胃，高劑量中藥組灌中藥0.04 mL/g，中劑量中藥組灌中藥0.02 mL/g+蒸餾水0.02 mL/g，低劑量中藥組灌中藥0.01 mL/g+蒸餾水0.03 mL/g，正常對照組、模型對照組均灌蒸餾水0.04 mL/g，喂服14 d。

1.2.5 實驗指標的檢測

1.2.5.1 體重和脾臟指數(shù) 各組小鼠稱量體重，于試驗結(jié)束后斷頸處死，取脾臟，用電子天平稱濕重，計算脾指數(shù)，脾臟指數(shù)=100%脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量（g/g）。

1.2.5.2 IgG和補體C3的檢測 于試驗第14天摘取眼球取血，室溫放置2 h后3000 r/min離心10 min將血清和紅細胞迅速小心地分離，離心得血清后嚴格按照ELISA試劑盒說明書方法檢測小鼠血清IgG和補體C3水平。

1.2.5.3 脾淋巴細胞 CD3、CD4、CD8、CD19、CD49b NK細胞、細胞因子IL-2、IFN-γ檢測 第14天取小鼠脾臟研磨成單細胞懸液經(jīng)篩網(wǎng)過濾于離心管中離心，棄上清再加入紅細胞裂解液離心，棄上清后加入PBS定容至1 mL，用倒置相差顯微鏡進行細胞計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞數(shù)為 1×107～10×107個， 加入標記抗小鼠 CD3、CD4、CD8、CD19、CD49b NK 細胞、 細胞因子 IL-2、IFN-γ熒光抗體抗體，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌2次，流式細胞儀檢測淋巴細胞和細胞因子指標的變化。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件分析，所有計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗。將資料進行正態(tài)性分析和Levene法方差齊性檢驗，行兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性采用LSD-t檢驗，方差不齊采用Tamhane法檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 體重和脾指數(shù)結(jié)果比較

正常對照組和模型對照組與各治療組第1天的體重均值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.216＞0.05），表明隨機分組成功。第14天的體重模型對照組比正常對照組減輕，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.020＜0.05），而模型對照組與各治療組體重比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.126、0.904、0.796，均 P ＞ 0.05），表明小鼠免疫抑制后引起體重減輕，而各復方中藥治療組對免疫抑制小鼠體重無影響。脾指數(shù)模型對照組比正常對照組降低（P=0.0001＜0.05），而模型對照組與各治療組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.967、0.255、0.941 ＞ 0.05），表明小鼠免疫抑制后引起脾指數(shù)降低，而各復方中藥治療組對免疫抑制小鼠脾指數(shù)無影響。見表1。

表1 各組體重和脾指數(shù)比較（x±s）

2.2 各組抗體IgG、補體及CD19結(jié)果比較

模型對照組比正常對照組IgG顯著增高（P=0.002＜0.01），C3顯著降低（正態(tài)分布方差不齊t檢驗，P=0.011＜0.05），而低劑量中藥組與模型對照組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P=0.001＜0.01），表明低劑量中藥組能顯著降低免疫抑制小鼠抗體IgG的濃度，升高免疫抑制小鼠補體C3濃度。見表2。

表2 抗體、補體及B淋巴細胞表面抗原CD19結(jié)果比較（x±s）

2.3 各組脾淋巴細胞 CD3＋、CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋結(jié)果比較

CD3+、CD4+、CD8+模型對照組均值均低于正常對照組 （P ＜ 0.05），CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+模型對照組水平與低劑量中藥組、中劑量中藥組、高劑量中藥組水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），顯示復方中藥對特異性T淋巴細胞和B淋巴細胞免疫無促進作用。見表3。

表3 T淋巴細胞表面抗原結(jié)果比較（x±s）

2.4 各組脾淋巴細胞CD49b+結(jié)果比較

CD49b+、IL-2、IFN-γ 模型對照組水平均低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），低劑量中藥組、中劑量中藥組、高劑量中藥組均值均增高，但僅低劑量中藥組CD49b+與模型對照組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P=0.008＜0.01），表明小劑量復方中藥對免疫抑制小鼠非特異性免疫NK細胞有免疫促進作用。IL-2、IFN-γ低劑量中藥組、中劑量中藥組與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（IL-2：P=0.004、P=0.039；IFN-γ：P=0.026、P=0.024，P ＜ 0.05或P＜0.01），表明小劑量、中劑量復方中藥對免疫抑制小鼠非特異性免疫細胞因子IL-2及IFN-γ有免疫促進作用。見表4。

表4 各組NK細胞及細胞因子比較（%，x±s）

3 討論

機體的免疫功能主要與T淋巴細胞和B淋巴細胞、單核巨噬細胞、NK自然殺傷細胞等免疫細胞及抗體、補體、免疫細胞產(chǎn)生的細胞因子有關(guān)。特異性免疫與T淋巴細胞、B淋巴細胞及B淋巴細胞活化產(chǎn)生的抗體有關(guān)，非特異性免疫與單核巨噬細胞、NK自然殺傷有關(guān)，而補體及細胞因子廣泛參與特異性免疫與非特異性免疫。根據(jù)中醫(yī)藥理論和現(xiàn)代藥理研究表明：西洋參補氣養(yǎng)陰，清熱生津，主要活性成分為皂苷類、多糖類和氨基酸類等，其中的活性多糖可以通過激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、補體、激活巨噬細胞和T、B淋巴細胞，誘生多種免疫因子等途徑對機體免疫產(chǎn)生廣泛的影響，從而提高機體免疫力[4]；黃芪益氣固表，能調(diào)節(jié)免疫功能，可治療氣虛感冒；枸杞滋補肝腎，能提高機體免疫功能，延緩抗衰老，長期服用可增強免疫功能；當歸補血活血，具有抗炎和改善血管功能的作用[5]。本文以常用補益劑西洋參、黃芪、當歸、枸杞組成的復方中藥湯劑為研究對象，全方具有補氣活血、滋補肝腎，滋陰益陽作用，觀察其對免疫器官、免疫細胞、抗體、補體、細胞因子等不同層面免疫功能的影響，探求其增強免疫的機制。

正常對照組和模型對照組與各治療組第1天的體重均值比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明隨機分組成功。環(huán)磷酰胺為常有免疫抑制劑，為細胞周期非特異性細胞毒藥物，其免疫抑制機制為對骨髓強大抑制作用，致T、B淋巴細胞絕對數(shù)量減少，并抑制淋巴細胞受特異性抗原刺激后母細胞的轉(zhuǎn)化[6]。本實驗采用其制作免疫抑制動物模型，實驗結(jié)束后觀察到體重、脾指數(shù)、CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、NK 細胞、補體C3、細胞因子IL-2、IFN-γ均降低，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明建立免疫抑制動物模型成功。模型對照組與各治療組體重和脾指數(shù)無差異（P＞0.05），各復方中藥治療組對免疫抑制小鼠體重和脾指數(shù)無影響，表明其在免疫器官層面無顯著性作用。脾指數(shù)模型對照組比正常對照組降低（P=0.0001），可能與促進免疫器官的生長作用因環(huán)磷酰胺對機體抑制作用過強而顯現(xiàn)不出來有關(guān)。

本實驗觀察復方中藥各劑量組與模型組比較對CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD19+均無差異，因此未能證實其對特異性細胞免疫及體液免疫有促進作用。以往有報道西洋參多糖對60℃射線照射致免疫抑制模型小鼠可增強Con A誘導的小鼠脾T淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力，增強小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應能力[7]；黃芪多糖對正常小鼠可增強Con A誘導的小鼠脾T淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力[8]；當歸多糖明顯促進健康人外周血T淋巴細胞增殖[9]；枸杞多糖明顯增強植物凝集素PHA活化的人外周血淋淋巴細胞的增殖[10]。復方中藥中四種單味藥均可促進T淋巴細胞免疫力，而組成的復方反而未得出促進T淋巴細胞免疫的結(jié)論，這可能與免疫模型不同引起藥物對機體敏感性不同有關(guān)，還與觀察T淋巴細胞指標不同及檢測方法不同有關(guān)。

補體是存在于血清和組織液中經(jīng)活化后具有酶活性的蛋白質(zhì)，補體成分可與多種免疫細胞相互作用，調(diào)節(jié)細胞增殖、分化，補體C3等可參與固定抗原，使抗原易被APC處理與遞呈，參與免疫應答的誘導，并參與清除免疫復合物及免疫記憶，補體系統(tǒng)是具有重要生物學作用的效應級聯(lián)放大系統(tǒng)。補體途徑分為經(jīng)典、替代和外源凝集素途徑[11]，補體C3是補體激活的三個級聯(lián)的一個關(guān)鍵組成部分[12]，因此本實驗選擇補體C3指標作為觀察補體系統(tǒng)功能。低劑量中藥組與模型對照組比較補體C3顯著升高（P=0.0001＜0.01），表明低劑量中藥組能顯著升高免疫抑制小鼠補體C3濃度，顯著促進免疫抑制小鼠補體系統(tǒng)的功能。

本實驗免疫抑制模型對照組與正常對照組比較抗體IgG是升高的，差異有高度統(tǒng)計意義（P=0.002），而高劑量中藥組、中劑量中藥組、低劑量中藥組IgG均值依次降低，且低劑量中藥組與模型對照組比較，差異顯著（P值=0.001），表明低劑量中藥組能顯著降低免疫抑制小鼠抗體IgG的濃度。機體抗原免疫后血清中的抗體其中IgM檢出時間最早，IgG檢出時間較晚但存留時間最長，IgA檢出時間最晚[13]。本實驗B淋巴細胞抗原CD19+在免疫抑制后下降，因IgG產(chǎn)生時間較晚但存留時間最長，在實驗14 d的時間節(jié)點上，IgG主要是造模前存留的，因此理論上模型組與正常對照組應無統(tǒng)計學差異。通?？乖c抗體結(jié)合，在補體的參與下，抗原與抗體結(jié)合產(chǎn)生幾何級聯(lián)放大效應，清除抗原的同時消耗了抗體，補體升高會導致抗體降低，補體降低也會導致抗體升高。本實驗免疫抑制后對補體也造成了強大的抑制，因而出現(xiàn)正常對照組IgG抗體低，模型組IgG抗體升高。本實驗B淋巴細胞抗原CD19+各中藥治療組與模型組無差異，其一定程度上反映了機體體液免疫功能，體液免疫產(chǎn)生的抗體理論上亦無差異，因此認為低劑量中藥組IgG降低是因為低劑量復方中藥可顯著升高補體所引起的。

NK自然殺傷細胞對病原體無嚴格選擇性，能識別多種病原體的共有成分，對多種病原體均有吞噬、殺傷作用。NK細胞是產(chǎn)生細胞因子IFN-γ主要的先天免疫細胞，NK細胞不需要事先暴露于抗原發(fā)揮其功能，通過自然的細胞毒性和的分泌細胞因子發(fā)揮防止微生物的侵襲和傳播的重要的免疫效應，NK細胞是天然免疫和獲得性免疫功能之間的橋梁，先天第一線防御癌癥和病原體的入侵的關(guān)鍵[14]。CD49是小鼠NK細胞主要標志物，本實驗選用其作為觀察NK細胞的功能指標。復方中藥低劑量組與模型組比較可顯著升高CD49（P=0.008＜0.01），顯示低劑量復方中藥能有效促進NK自然殺傷細胞數(shù)量。在此需要說明的是復方中藥表現(xiàn)出的對機體免疫促進作用并不是由于中和環(huán)磷酰胺的藥效而引起的，因為環(huán)磷酰胺的半衰期為4 h，24 h后已經(jīng)過了6個半衰期，機體環(huán)磷酰胺的血藥濃度僅有1/64，因此24 h后喂服中藥不存在中和環(huán)磷酰胺的藥效，表明小劑量復方中藥對免疫抑制小鼠非特異性免疫NK細胞有免疫促進作用。

輔助性Th1細胞受抗原刺激分泌細胞因子IL-2和IFN-γ，IL-2刺激CTL細胞增殖與分化，IFN-γ可誘導單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、皮膚成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、星狀細胞等MHCⅡ類抗原的表達，使其參與抗原提呈和特異性免疫的識別過程；IFN-γ還能增強巨噬細胞表面受體Fc的表達，促進巨噬細胞吞噬免疫復合物、抗體包被的病原體和腫瘤細胞[15]；IL-2和IFN-γ都可以增強NK細胞細胞毒活性。因此IL-2和IFN-γ是反映機體免疫功能的重要指標。本實驗中劑量中藥組及低劑量中藥組與模型組比較均能升高IL-2和IFN-γ（P＜0.05），表明一定劑量范圍的復方中藥對免疫細胞因子有促進作用。

本實驗復方中藥藥理毒理試驗未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用，但高劑量中藥組對所有免疫指標均無促進作用，說明藥物劑量過大對機體還是有一定的不利影響，中藥中既使補益藥，也有一定的副作用。雖然都是補氣養(yǎng)陰活血的補益藥，正應了中醫(yī)理論有“氣有余便是火”，補氣有余易產(chǎn)生火邪。

因此，復方中藥（由西洋參、黃芪、枸杞、當歸等多味藥組成）在一定劑量范圍內(nèi)，雖然還未能證實對機體特異性細胞免疫和體液免疫有促進作用，但對非特異性細胞免疫及體液免疫有顯著促進作用。

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