綠衣枳殼總黃酮提取工藝的研究*

高偉城，藍(lán)曉慶，潘 馨

(1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，漳州363600;2.培力(南寧)藥業(yè)有限公司，南寧530007;3.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州350108)

綠衣枳殼總黃酮提取工藝的研究*

高偉城1，藍(lán)曉慶2，潘 馨3

(1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，漳州363600;2.培力(南寧)藥業(yè)有限公司，南寧530007;3.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州350108)

目的:研究綠衣枳殼中總黃酮的提取工藝。方法:采用正交試驗法研究綠衣枳殼總黃酮的最佳提取工藝，考查了乙醇濃度、料液比、提取時間及提取次數(shù)對綠衣枳殼提取物中總黃酮量的影響。結(jié)果:確立了綠衣枳殼中總黃酮最佳提取條件為:90%的乙醇為溶劑、料液比為1∶10、提取時間為2 h、提取2次。結(jié)論:在最佳提取工藝條件下，綠衣枳殼提取物中總黃酮含量分別為60.914、60.788和60.915 mg/g，表明本研究提取工藝穩(wěn)定可行。

綠衣枳殼，總黃酮，提取工藝，正交試驗

綠衣枳殼來源于蕓香科植物枸橘Poncirus trifoliate (L.)Raf近成熟的果實，具有破積消食、理氣健胃的功效［1］。因品質(zhì)優(yōu)良，長期以來遠(yuǎn)銷臺灣地區(qū)、南韓、東南亞各國，是本省極具發(fā)展前途、可用于出口創(chuàng)匯的優(yōu)質(zhì)傳統(tǒng)藥材［2］。現(xiàn)代藥理表明，其對處于不同狀態(tài)的胃腸平滑肌具有雙向調(diào)節(jié)作用，而主要有效成分為黃酮類化合物［3］。潘馨［4］等采用GC－MS法對綠衣枳殼揮發(fā)油進(jìn)行分析，結(jié)果表明綠衣枳殼與其他枳殼品種在化學(xué)成分烯、醇、酸、烷烴上絕大多數(shù)相同，從化學(xué)成分上可以解釋綠衣枳殼與枳殼有相同的用途。

因此，為深入研究其藥效價值，本研究采用正交試驗法優(yōu)選綠衣枳殼的乙醇提取工藝，以期為其制劑及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

Nicolet Evolution 300智能型紫外可見分光光度計(Thermo Scientific corporation)、FA2 104N萬分之一天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、DZF－300真空干燥箱(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)、RE－52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，柚皮苷(中國藥品生物制品檢定所，批號110722－201111)，乙醇等其他試劑為分析純。綠衣枳殼藥材采購于福建閩侯，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院車蘇容副教授鑒定為綠衣枳殼Poncirus trifoliate(L.)Raf。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液的制備精密稱取120℃干燥至恒重的柚皮苷對照品5.6 mg，用90%乙醇超聲溶解，定容于25 ml的量瓶中，搖勻，即得，0.224 mg/ml的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的乙醇提取物干浸膏2.5 mg，用90%乙醇超聲溶解，定容于25 ml的量瓶中，搖勻，即得，備用。

2.2 測定波長的選擇將對照品及供試品溶液在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描，結(jié)果對照品與供試品溶液在283 nm處均有最大吸收峰，故選擇283 nm作為檢測波長。見圖1。

圖1 紫外光譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取柚皮苷對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 ml，分別置于25 ml的量瓶中，用90%乙醇超聲稱溶解并稀釋至刻度，搖勻;以90%乙醇溶液作空白對照，在283 nm處測定吸光度A，以吸光度A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得其回歸方程為:A= 0．026 6 C－0．020 4(r=0．999 9)，線性范圍為4.48～35.84 μg/ml。

2.4 加樣回收率試驗精密稱取同一樣品0.007 9 g，共6份，分別加入柚皮苷對照品，按照“2.1.2”項下供試品溶液的制備方法制備供試品液，在283 nm處測定其吸光度值，計算回收率。結(jié)果平均回收率為97.79%，RSD%為0.84%，結(jié)果見表1。

2.5 供試品溶液的測定將上述供試品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線下的測定方法測定其吸光度值，依回歸方程計算得到總黃酮的質(zhì)量濃度，再計算干浸膏中的總黃酮量。

2.6 單因素試驗

2.6.1 乙醇濃度的考查精確稱取6份綠衣枳殼粗粉10.0 g，分別加入濃度為40%、50%、60%、70%、80%和90%的乙醇100 ml，料液比為1∶10，加熱回流提取2次，每次1 h，合并提取液并減壓濃縮至干浸膏，按供試品溶液方法進(jìn)行測定，重復(fù)3次，結(jié)果見表2;可知，隨著乙醇濃度的提高，綠衣枳殼總黃酮量呈上升趨勢，乙醇濃度為70%～90%時總黃酮含量高于其他的濃度。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

表2 __乙醇濃度對總黃酮量的影響

2.6.2 料液比的考查精確稱取6份綠衣枳殼粗粉10.0 g，分別加入濃度為80%的乙醇60、80、100、120、150和180 ml，料液比為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15和1∶18，加熱回流提取2次，每次1 h，合并提取液并減壓濃縮至干浸膏，按供試品溶液方法進(jìn)行測定，重復(fù)3次，結(jié)果見表3;可知，隨著料液比的升高，料液比為1∶12時總黃酮含量增加不是很明顯。

表3 料液比對總黃酮量的影響

2.6.3 提取時間的考查精確稱取6份綠衣枳殼粗粉10.0 g，分別加入濃度為80%的乙醇100 ml，料液比為1∶10，加熱回流提取2次，提取時間分別為1、1.5、2.0、2.5、3.0和3.5 h，合并提取液并減壓濃縮至干浸膏，按供試品溶液方法進(jìn)行測定，重復(fù)3次，結(jié)果見表4;可知，隨著提取時間的延長，總黃酮含量于2.0 h處逐漸趨于平緩，在5.0 h時達(dá)到最高點。

表4 提取時間對總黃酮量的影響

2.7 正交試驗及其結(jié)果在實驗中，由于各因素之間相互交叉影響，因此為全面考慮乙醇提取法的工藝參數(shù)，根據(jù)單因素初篩試驗結(jié)果，確定以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)、提取次數(shù)(D)為四種因素進(jìn)行正交試驗設(shè)計，我們以總黃酮量為考查指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗，以測定綠衣枳殼中總黃酮含量，因素水平表見表5，結(jié)果見表6，方差分析見表7。

表5 因素水平表

表6 L9(34)正交試驗結(jié)果

表7 方差分析

從極差和方差分析可知，以總黃酮含量為評價指標(biāo)，各因素對提取效果的影響程度依次為A＞B＞D＞C，其中因素A(乙醇濃度)有顯著性影響，取A3即90%乙醇為提取溶劑，B、D、C均無顯著性影響，均為次要因素;因此，從節(jié)省時間及大生產(chǎn)的實際要求考慮，綠衣枳殼總黃酮的最佳提取工藝條件可定為A3B2C1D2，即用90%乙醇、1∶10的料液比、提取時間為1.5 h、提取次數(shù)為2次。

2.8 驗證試驗精確稱取3份綠衣枳殼藥材粗粉10.0 g，按照最佳工藝條件平行操作，A3B2C1D2進(jìn)行試驗，結(jié)果總黃酮含量分別為60.914、60.788和60.915 mg/g;驗證的試驗結(jié)果表明本研究優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

3.1 總黃酮含量測定方法一般有NaNO2－Al(NO3)3－NaOH法、三氯化鋁比色法、堿比色法、直接測定法等。江周虹研究表明［5］，采用柚皮苷直接測定法作為枳殼中總黃酮的含量測定效果較好，故本試驗參考文獻(xiàn)中對于含有柚皮苷等類似成分的黃酮的紫外測定方法，選擇綠衣枳殼中含有的黃酮類成分柚皮苷［6］為指標(biāo)成分，采用直接測定法對其進(jìn)行總黃酮含量測定。

3.2 綠衣枳殼是本省大宗道地藥材之一，其主要黃酮類化合物為二氫黃酮類，有柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等，具有許多生理活性。因此，對其進(jìn)行開發(fā)與利用，對促進(jìn)地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展、滿足地方用藥和外貿(mào)出口需要有十分現(xiàn)實的意義。

3.3 本研究提取工藝具有穩(wěn)定性好、總黃酮量高、操作簡便等優(yōu)點，為綠衣枳殼總黃酮的深度開發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ)。

1黃堅航.福建綠衣枳殼的本草考證［J］.中藥材，2001，24(6):429－430

2李煌，張夢云.不同采收期綠衣枳殼中柚皮苷的含量測定［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2008，15(7):43－44

3徐優(yōu)曉，蘇孝共.枳殼理氣作用的臨床運(yùn)用［J］.江西中醫(yī)藥，2005，36 (5):57－58

4潘馨，梁鳴.綠衣枳殼中揮發(fā)油的氣質(zhì)聯(lián)析［J］.藥物分析雜志，2004，24(2):200－202

5江周虹.枳殼總黃酮的質(zhì)量控制及腸吸收研究［D］.杭州:浙江大學(xué)，2007:4－6

6潘馨.綠衣枳殼中柚皮苷含量的測定方法的研究［J］.中南藥學(xué)，2005，3(2):82－83

R284

A

1006－5687(2014)02－0038－03

2014－01－13

福建省自然基金項目(No.2006F5053);陳可冀基金項目(No.CKJ2008084)