CD83＋成熟樹突細(xì)胞和CD11b＋耐受性樹突細(xì)胞在人頸動(dòng)脈粥樣硬化病變中的分布

鄧瓊，胡何節(jié)，方征東，王曉天，孫小杰

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院血管外科，合肥 230001）

CD83＋成熟樹突細(xì)胞和CD11b＋耐受性樹突細(xì)胞在人頸動(dòng)脈粥樣硬化病變中的分布

鄧瓊，胡何節(jié)，方征東，王曉天，孫小杰

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院血管外科，合肥 230001）

目的探討CD83＋成熟樹突細(xì)胞（mDC）和CD11b＋耐受性樹突細(xì)胞（tolDC）在人頸動(dòng)脈粥樣硬化病變中的分布。方法收集頸動(dòng)脈狹窄患者行頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)的頸動(dòng)脈內(nèi)膜標(biāo)本20例，常規(guī)石蠟切片，HE染色，免疫組織化學(xué)染色觀察CD83和CD11b陽(yáng)性反應(yīng)血管樹突狀細(xì)胞的分布。結(jié)果CD83＋mDC和CD11b＋tolDC主要分布在頸動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊、泡沫細(xì)胞以及新生血管周圍，成熟的CD83＋mDC細(xì)胞密度（8.34 ±1.20）個(gè)細(xì)胞／HPF較CD11b＋tolDC細(xì)胞密度（5.31±1.24）個(gè)細(xì)胞／HPF高。結(jié)論CD83＋mDC和CD11b＋tolDC在人頸動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)脈內(nèi)膜均有分布，mDC的增多和tolDC的減少可能與人頸動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

頸動(dòng)脈狹窄；樹突細(xì)胞；細(xì)胞計(jì)數(shù)

頸動(dòng)脈粥樣硬化（CAS）所致的頸動(dòng)脈狹窄是目前威脅人類健康的主要疾病之一，研究認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥免疫性疾病，炎癥和免疫是CAS發(fā)病的重要環(huán)節(jié)［1］。目前樹突細(xì)胞（DCs）是已知的體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞（APC），DC對(duì)自身抗原異常提呈，通過(guò)激活局部T淋巴細(xì)胞，來(lái)啟動(dòng)由多種細(xì)胞參與的免疫炎性反應(yīng)，從而在CAS病理演進(jìn)中扮演著重要的角色［2-3］，mDC表達(dá)CD83［4］而tolDC表達(dá)CD11b［5］，目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)CAS的研究其對(duì)象多為動(dòng)物模型，有關(guān)DCs的研究也多為mDC而對(duì)tolDC研究較少，本文以CAS患者的病變動(dòng)脈內(nèi)膜為研究對(duì)象，通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)頸動(dòng)脈內(nèi)膜中的CDl1b和CD83分子進(jìn)行檢測(cè)，探討mDC和tolDC在CAS病變中的分布。

圖1 CAS患者HE染色病理學(xué)改變（×400)

圖2 CD83和CD11b在CAS組中的表達(dá)(SP法，×400)

1 材料和方法

1.1 臨床標(biāo)本 收集2011年10月至2013年5月安徽省立醫(yī)院血管外科頸動(dòng)脈狹窄患者行頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)獲得的頸動(dòng)脈內(nèi)膜標(biāo)本20例（經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意并患者知情同意），標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定?；颊吣挲g48～72（64.2±10.7）歲，其中男性患者12例，女性患者8例，合并高血壓者14例，合并糖尿病者5例，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)確診：①臨床表現(xiàn)具有典型的臨床特征，②頸動(dòng)脈彩色多普勒超聲或者頸動(dòng)脈CTA，③組織病理學(xué)診斷。所有患者在就診2月內(nèi)沒(méi)有使用免疫調(diào)節(jié)劑治療，亦未合并自身免疫性疾病和（或）惡性腫瘤。

1.2 主要試劑 兔抗人CD83單克抗體（LSC176864）購(gòu)自LSBio公司，兔抗人CD11b單克抗體（ab1333571）購(gòu)自Abcom公司，SP-9000免疫組織化學(xué)染色試劑盒，DAB酶底物顯色劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫染色方法 用10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制成5 mm厚的連續(xù)切片，所有標(biāo)本各取兩張分別用CD11b抗體和CD83抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。免疫組織化學(xué)步驟如下：切片脫石蠟、水化、抗原修復(fù)，依次滴加過(guò)氧化物酶阻斷劑、封閉血清、一抗、生物素標(biāo)記的二抗、鏈霉素抗生物素一過(guò)氧化物酶溶液，DAB顯色，復(fù)染，封片。

1.4 染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)［6］①樹突細(xì)胞計(jì)數(shù)：細(xì)胞計(jì)數(shù)采用OlympusBX40顯微鏡在×400下觀察。染色強(qiáng)度采用OlympusUPlanFL×40的物鏡觀察：顯示細(xì)胞質(zhì)染色或膜染色的細(xì)胞都包括在陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)中。每張免疫組織化學(xué)切片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野進(jìn)行CD11b或CD83陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，再分別取其平均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，即每高倍視野的細(xì)胞數(shù)／HPF。②CD11b細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)：染色后的切片置光鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜呈黃褐色，且具有不規(guī)則樹枝狀突起的細(xì)胞為CD11b＋細(xì)胞。③CD83細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)：以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)黃褐色染色，且具有不規(guī)則樹枝狀突起的細(xì)胞為CD83＋細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，CD11b和CD83在CAS組織中表達(dá)的差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 頸動(dòng)脈內(nèi)膜變性，局部管壁斑塊增厚，可見(jiàn)膽固醇結(jié)晶和鈣鹽沉積，少量淋巴細(xì)胞、泡沫細(xì)胞、紅細(xì)胞和多核巨細(xì)胞浸潤(rùn)，外膜面纖維組織增生伴玻璃樣變性（圖1）。

2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 20例CAS病變組織中，耐受性樹突細(xì)胞由CD11b特征性標(biāo)記，成熟樹突細(xì)胞由CD83特征性標(biāo)記，成熟的CD83＋樹突細(xì)胞和耐受性的CD11b＋樹突狀細(xì)胞主要分布在內(nèi)膜斑塊處以及泡沫細(xì)胞、新生滋養(yǎng)血管周圍（圖2），CD83表達(dá)明顯多于CD11b，CD83＋mDC細(xì)胞密度為（8.34±1.20）個(gè)細(xì)胞／HPF，CD11b＋tolDC密度為（5.31±1.24）個(gè)細(xì)胞／HPF，兩者相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所取標(biāo)本均能肉眼可見(jiàn)AS斑塊，行HE染色可見(jiàn)頸動(dòng)脈內(nèi)膜變性，局部管壁增厚，伴有膽固醇結(jié)晶及鈣鹽的沉積，以及淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，從病理分析：人頸動(dòng)脈隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸出現(xiàn)退行性改變，動(dòng)脈內(nèi)膜更易受到某些侵襲因素破壞導(dǎo)致內(nèi)膜屏障功能減低，發(fā)生CAS的風(fēng)險(xiǎn)增加。此外我們通過(guò)免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)CD83＋mDC在頸動(dòng)脈內(nèi)膜大量分布，尤其豐富在不穩(wěn)定斑塊、泡沫細(xì)胞以及新生滋養(yǎng)血管周圍，而CD11b＋tolDC少量分布于頸動(dòng)脈內(nèi)膜，主要分布在新生滋養(yǎng)血管周圍，并且CD83＋mDC細(xì)胞密度高于CD11b＋tolDC細(xì)胞密度［7-9］，Yilmaz等［10］研究發(fā)現(xiàn)在不穩(wěn)定斑塊肩部區(qū)域有活性的DC與T細(xì)胞成簇分布，大量表達(dá)CD83等標(biāo)志物，本實(shí)驗(yàn)與Yilmaz等的研究結(jié)果相一致。本研究證實(shí)tolDC和mDC在頸動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)膜均有分布，tolDC細(xì)胞密度與mDC細(xì)胞密度比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說(shuō)明tolDC細(xì)胞在AS病變頸動(dòng)脈內(nèi)膜的分布的減少和mDC在其分布的增多與CAS病變的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，至于兩者在CAS病變中具體的參與機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究證實(shí)CAS存在一定的免疫反應(yīng)來(lái)抵御病變的進(jìn)一步發(fā)展，國(guó)內(nèi)外大量研究表明mDC不但參與了AS的發(fā)生發(fā)展，而且促進(jìn)了AS的斑塊形成及發(fā)展成為不穩(wěn)定性斑塊，tolDC能誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞下調(diào)免疫反應(yīng)，本研究發(fā)現(xiàn)tolDC在頸動(dòng)脈內(nèi)膜少量分布，這或許表明tolDC的缺乏不足以引起抑制炎癥的免疫反應(yīng)來(lái)抵御AS的病變進(jìn)展，為了抑制炎癥的進(jìn)展，可以設(shè)想誘導(dǎo)tolDC形成而建立細(xì)胞免疫療法來(lái)治療CAS等AS疾病，實(shí)現(xiàn)免疫細(xì)胞多靶點(diǎn)多環(huán)節(jié)的調(diào)控，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值，但是需要進(jìn)一步的研究來(lái)尋求有效的方法誘導(dǎo)和釋放tolDC而又不丟失它的免疫耐受功能。

（本文圖1，2見(jiàn)插圖1-1）

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The distribution of CD83＋mDC and CD11b＋tolDC in human carotid atherosclerotic lesions

DENGQiong，HU Hejie，F(xiàn)ANGZhengdong，WANGXiangtian，SUN Xiaojie（Vascular Surgery，Anhui Provincial Hospital，Hefei 230001，China）

ObjectiveTo investigate the distribution of CD83＋mature dendritic cell（mDC）and CD11b＋tolerogenic dendritic cell（tolDC）in human carotid batherosclerotic lesions.Methods A total of 20 carotid intima specimens were collected as the object of from the carotid stenosis patients with carotid artery intima stripped.Paraffin sections were made and were stained with HE routinely.Immunohistochemical method was used to examine the distribution of CD11b and CD83 positive reaction dendritic cells（DC）.ResultsCD83＋mDC and CD11b＋tolDC were mainly distributed in the carotid artery intimal plaque，foam cells and around the new blood vessels.The average number mature CD83＋mDC per high power field（HPF）was 8.34±1.20 and significant decrease was observed in the density of tolerogenic CD11b＋tolDC 5.31±1.24 cells／HPF，P＜0.05.Conclusions CD83＋mDC and CD11b＋tolDC were all both distributed in human carotid artery atherosclerotic arterial intima，and the increased in the number of mDC and the decreased in the number of tolDC may be associated with the development of carotid atherosclerosis.

Carotid stenosis；Dendritic Cells；Cell Count

R543.4

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.01.015

2013-09-06）

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（11040606M199）

鄧瓊，碩士在讀，Email：18356039711＠163.com

胡何節(jié)，教授，碩士生導(dǎo)師，Email：huhejie＠hotmail.com

Corresponding auther：HU Hejie，Email：huhejie＠hotmail.com