HPLC-ELSD法測定復方阿膠黃芪膏中黃芪甲苷含量的可靠性

李矗，劉圣，王珍

（1.安徽醫(yī)科大學附屬安徽省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，合肥 230001；2.安徽省食品藥品審評認證中心）

HPLC-ELSD法測定復方阿膠黃芪膏中黃芪甲苷含量的可靠性

李矗1，劉圣1，王珍2

（1.安徽醫(yī)科大學附屬安徽省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，合肥 230001；2.安徽省食品藥品審評認證中心）

目的建立復方阿膠黃芪膏中黃芪甲苷的含量測定方法。方法采用HPLC-ELSD法，Alltima C18柱（250mm×4.6 mm，5μm），乙腈-水（35∶65）為流動相，ELSD漂移管溫度103℃，載氣（N2）壓力：0.2 MPa。結果黃芪甲苷在88.1～440.5μg／mL范圍內呈良好的線性關系，r＝0.9998（n＝5）。平均回收率97.05%，RSD＝1.22%。結論HPLC-ELSD法準確可靠，可用于復方阿膠黃芪膏的質量控制。

黃芪；色譜法，高壓液相；質量控制

復方阿膠黃芪膏由阿膠、黃芪、山楂、枸杞子、黑芝麻、龍眼肉、明膠等制成，具有健脾消積，行氣和胃之功［1］。黃芪為方中臣藥，而黃芪甲苷為黃芪的主要活性成分之一，故選擇黃芪甲苷作為控制該產品質量的定量指標，黃芪甲苷含量測定常用薄層掃描法，但該法準確度差，重復性不強，操作繁瑣［2-4］，而HPLC-ELSD法可快速、有效準確地測定黃芪甲苷的含量。

1 儀器與試劑

Agilent1100高效液相色譜儀（美國），包括：四元泵，在線脫氣機，柱溫箱，化學工作站（chimstation system工作站），Alltech2000ELSD檢測器（美國）；梅特勒托利多xp56型百萬分之一電子天平（瑞士）；賽多利斯BSA224S電子分析天平（德國）。復方阿膠黃芪膏（批號：130110、130112、130114）和陰性制劑均由安徽省立醫(yī)院提供；黃芪甲苷（中國藥品生物制品檢定所，批號：110781-200512）；乙腈和甲醇為色譜純；水為重蒸餾水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Alltima C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）柱；流動相：乙腈-水（35：65）；柱溫：30℃；流速：1.0 mL／min；ELSD漂移管溫度：103℃，載氣（N2）壓力：0.2MPa。

2.2 對照品溶液的制備 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1毫升含0.4405 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取復方阿膠黃芪膏適量，研勻，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，用水補足減失的重量，搖勻，離心（4000 r／min，5 min），精密量取上清液25 mL置分液漏斗中，用水飽和正丁醇提取5次，每次25 mL，合并正丁醇提取液，用2%氫氧化鈉試液洗滌兩次，每次25 mL，棄去洗滌液，再用正丁醇飽和的水洗滌兩次，每次25 mL，棄去水溶液，分取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并定量轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm的濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備 取缺黃芪的缺味陰性制劑，按“供試品溶液的制備”項下的方法處理，即得。

2.5 專屬性實驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各20μL，注入液相色譜儀測定，結果在與對照品色譜相應位置上，供試品溶液與其他組分分離度良好，陰性對照無干擾，見圖1。理論板數(shù)以黃芪甲苷峰計算為6533，黃芪甲苷峰與相鄰峰分離度為3.88（R＞1.5），拖尾因子為0.99（0.95≤T≤1.05），符合藥典規(guī)定。

2.6 線性關系考察 分別精密吸取濃度為0.4405 mg／mL的對照品溶液2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別吸取上述對照品溶液各20μL，依次注液相色譜儀中，測定峰面積。以對照品濃度的常用對數(shù)值為橫坐標，峰面積常用對數(shù)值為縱坐標，計算得回歸方程為：Y＝1.4364X-0.3365（r＝0.9998，n＝5）。結果表明：黃芪甲苷濃度在88.1～440.5μg／mL之間濃度對數(shù)值與峰面積對數(shù)值呈良好的線性關系。

2.7 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測定。重復進樣5次，測定峰面積值，分別為：1324.9、1375.2、1373.3、1359.0、1380.5、1385.6，RSD為1.63%，結果表明：表明本法精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，分別間隔0、2、4、6、8、10 h后依法測定，測定峰面積值，分別為：1305.9、1377.8、1387.8、1377.4、1343.4、1322.3，RSD為2.49%，結果表明：表明供試品溶液在10 h內穩(wěn)定性良好。

2.9 重現(xiàn)性實驗 取同一批號（130110）的樣品6份，分別按上述方法制備、測定黃芪甲苷含量，結果含量分別為：0.4532 mg／粒、0.4499 mg／粒、0.4429 mg／粒、0.4299 mg／粒、0.4339 mg／粒、0.4430 mg／粒，平均含量為0.4421 mg／粒，RSD為2.03%，結果表明：表明本法重現(xiàn)性良好。

2.10 回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品（0.4421 mg／粒）9份，分別精密加入一定量的黃芪甲苷對照品，按供試品溶液制備方法制備并測定，結果表明：本法具有良好的回收率，見表1。

2.11 樣品測定 按上述色譜條件，依法對3批樣品中黃芪甲苷的含量進行了測定，結果：批號130110含量為0.4421 mg／粒、批號130112含量為0.4609 mg／粒、批號130114含量為0.4655 mg／粒。

表1 回收率測定結果

3 討論

制備供試品溶液時，曾對洗滌萃取后的正丁醇溶液選擇了2%NaOH溶液和氨試液，結果發(fā)現(xiàn)以2%NaOH溶液洗滌正丁醇所得供試品溶液中黃芪甲苷的含量較高。還對萃取后是否通過D101型大孔吸附樹脂柱進行了比較，結果發(fā)現(xiàn)通過D101型大孔吸附樹脂柱對結果無明顯影響，不通過D101型大孔吸附樹脂柱的供試品溶液，在黃芪甲苷峰附近也無干擾峰，故最終確定此供試品溶液的制備方法。

關于流動相的選擇，考察的2010年版藥典中黃芪甲苷項下的流動相乙腈—水（32∶68）和相關報道中的流動相乙腈—水（30∶70）及乙腈—水（35∶65），結果均能使黃芪甲苷達到藥典規(guī)定的分離度和理論塔板數(shù)，但乙腈—水（32∶68）和乙腈—水（30∶70）相對分離時間較長，故選擇乙腈—水（35∶65）為流動相進行分析［5-8］。

黃芪甲苷的含量測定方法報道多為薄層掃描法，但該方法結果準確性受顯色效果的影響較大。而本研究結果顯示以蒸發(fā)光散射檢測器測定黃芪甲苷的含量，黃芪甲苷濃度在88.1～440.5μg／mL之間濃度對數(shù)值與峰面積對數(shù)值呈良好的線性關系，而且以蒸發(fā)光散射檢測器測定精密度良好、穩(wěn)定性高、重復性好。

［1］ 國家藥典委員會.中國藥典（2010年版一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：175.

［2］ 周晶.薄層掃描法測定六味補氣膠囊中黃芪甲苷的含量［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17（1）：37-38.

［3］ 張昌文，彭宣文.薄層掃描法測定升胃顆粒劑中黃芪甲苷的含量［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2012，8（9）：20.

［4］ 劉喬明，劉躍林.健心膠囊的制備及質量控制［J］.中國藥業(yè)，2012，21（11）：31.

［5］ 國家藥典委員會.中國藥典（2010年版一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：283.

［6］ 白娟，張潔，李成網.HPLC-ELSD測定玉屏風軟膠囊中黃芪甲苷的含量［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（16）：102.

［7］ 江延輝.HPLC-ELSD法測定復方芪參片中黃芪甲苷的含量［J］.中醫(yī)現(xiàn)代中藥，2013，15（4）：314.

［8］ 郭強.HPLC-ELSD法測定老年咳喘片中黃芪甲苷的含量［J］.中醫(yī)研究，2013，26（6）：76.

Determ ination of astragaloside IV in Compound Ejiao Huangqi Extract by HPLC-ELSD method

LIChu*，LIU Sheng，WANG Zhen（*The Affiliated Anhui Provincial Hospital of AnhuiMedical University，Hefei230001，China）

ObjectiveTo establish amethod for the determination of astragaloside IV in Compound Ejiao Huangqi Extract.Method HPLC-ELSDmethod was used in the quantitative analysis by using a Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5μm）column.The mobile phase was acetonitrile-water（35：65），ELSD evaporator tube temperature was 103℃，and pressure of carrier-gas（N2）was0.2MPa.ResultsThe calibration curve had good linear relationship within the range of 88.1-440.5μg／m L for astragaloside IV（r＝0.9998，n＝5）.The average recovery was 97.05% and RSD＝1.22%.ConclusionThe HPLC-ELSDmethod is accurate and reliable，which can be used for the quality control of compound Ejiao Huangqi Extract.

Astragalusmembranaceus；Chromatography，high pressure liquid；Quality control

R282.71

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.06.006

2014-06-26）

李矗，副主任藥師，Email：leetrue2000＠126.com