某區(qū)甲型H1N1流感病毒分離鑒定及同源性的分析

曹 曉 鞏 飚* 胡淮潔 許 嬌 冉 冉

（開封市疾病預防控制中心檢驗科，河南 開封 475000）

某區(qū)甲型H1N1流感病毒分離鑒定及同源性的分析

曹 曉 鞏 飚* 胡淮潔 許 嬌 冉 冉

（開封市疾病預防控制中心檢驗科，河南 開封 475000）

目的檢測并分離甲型H1N1流感病毒，對開封地區(qū)首次分離到的病毒株進行全基因組序列測定及同源性分析，為研究流感病毒的流行及變異規(guī)律提供科學依據(jù)。方法采用Real-time RT-PCR方法檢測，篩選確定出甲型H1N1流感病毒陽性標本；利用狗腎傳代細胞分離得到甲型H1N1流感病毒株A/Kaifeng/01/2009（H1N1）；測定并分析其全基因組序列；利用序列比對進行了同源性分析。結果從1828份流感樣病例中檢出甲型H1N1流感病毒陽性標本286份，陽性率15.6%。在開封地區(qū)首次獲得甲型H1N1流感病毒株及全基因組序列。基因組序列分析表明：該毒株與2009年大流行株高度同源，為同一進化分支。與以往流行的豬流感病毒株對比發(fā)現(xiàn)，HA基因有12個堿基發(fā)生了點突變。結論MDCK細胞對甲型H1N1 流感病毒具有較高敏感性；開封地區(qū)首例甲型H1N1流感病例分離病毒株與北美流行株高度同源；相對于以往古典型豬流感代表株出現(xiàn)了HA蛋白抗原性漂移；為今后進一步開展甲型H1N1 流感病毒分子生物學研究奠定基礎。

甲型H1N1流感；病毒分離；序列分析；同源性

2009年肆虐全球的甲型HINI流感由一種新型流感病毒引起，該病毒基因組由禽流感、豬流感和人流感病毒基因混合而成[1,2]。此次流感傳播速度快、范圍廣，動物實驗研究已經(jīng)證實導致此次流感的新型甲型H1N1流感病毒較季節(jié)性流感具有更強的感染力[3,4]。本研究通過了解開封地區(qū)甲型H1N1流感病毒株的全基因組序列，在掌握北美地區(qū)和歐洲豬流感病毒流行情況的基礎上，運用生物信息學技術，通過序列同源性比較和基因進化樹分析，得到了一些初步結論，同時也對我國流感病毒的研究工作進行了部分總結。這對開封地區(qū)甲型H1N1流感病毒的基因起源和遺傳進化的探究，對研究我國流感病毒的分子進化機制，及時發(fā)現(xiàn)可能出現(xiàn)的新病毒，具有極其重要的價值。

1 材料與方法

1.1 材料

①標本來源：鼻咽拭子標本286份，來自流感監(jiān)測哨點醫(yī)院（開封市第一人民醫(yī)院）采集的甲型H1N1流感確診病例標本。②試劑：甲型H1N1流感病毒熒光RT-PCR法檢測試劑盒（北京金豪）；病毒RNA提取試劑盒（德國QIAGEN）；逆轉錄試劑盒購于公司（美國Promega）；PCR 反應試劑和Rnase inhibitior（大連TAKARA公司）；瓊脂糖凝膠（大連TAKARA公司）；狗腎傳代細胞（MDCK）由國家流感中心提供、本實驗室保存。③引物：流感病毒逆轉錄通用引物為universal primer 12 : 5’-A GCAAAA GCA GG-3’，全基因組PCR擴增引物序列見參考文獻[5]。④實驗條件：以下操作均在在BSL-2實驗室進行。

1.2 方法

①甲型H1N1流感病毒檢測：采用Real-time RT-PCR方法，確定甲型H1N1流感病毒陽性標本。②病毒分離：采用第26～28代MDCK細胞進行病毒分離，具體方法見參考文獻[6]。③病毒RNA提取：按病毒RNA提取試劑盒（QIAGEN）中說明書提取，將提取到的病毒RNA 保存于-70 ℃?zhèn)溆谩＂躢DNA的制備：按逆轉錄試劑盒操作說明進行。產(chǎn)物置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩＂萑蚪MPCR 擴增與測序：配制50 μL反應體系如下：10×PCR buffer 5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）4 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，ExTaqase （5 Unit/μL）1 μL，RNase Free Water 30 μL，逆轉錄產(chǎn)物6 μL。PCR反應條件為：95 ℃15 min，94 ℃ 30 s變性，50 ℃ 30 s退火，72 ℃ 1 min延伸，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃保溫。取4 μL PCR反應產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳觀察目的條帶。產(chǎn)物達50 ng/μL后，送大連TAKARA公司進行測序。⑥同源性及基因變異分析：將病毒各節(jié)段的核酸序列與GENBANK上公布的 A/California/04/2009（H1N1）序列進行同源性比較，分析此次病毒分離株HA基因重要位點變異情況。

2 結 果2.1 病毒檢測：從1828份流感樣病例標本中檢出286例甲型H1N1流感病毒陽性標本。

2.2 病毒分離：將甲型H1N1流感病毒陽性標本接種MDCK細胞，逐日觀察細胞病變（CPE） 情況。接種第一代24 h左右，即可鏡檢觀察到輕微CPE ，接種72～96 h CPE可達+++～++++。接種第二代40 h左右，CPE可達+++～++++，CPE變化的進程為腫脹→圓縮→脫落→溶解，見圖1。分離的53株病毒，經(jīng)Real-time PCR鑒定全部為甲型H1N1病毒。開封地區(qū)首例甲型H1N1流感病例分離株命名為：A/ Kaifeng/01/2009（H1N1）。

2.3 同源性分析：將各擴增片段的核苷酸序列用軟件拼接，獲得病毒株8個節(jié)段的完整核苷酸序列。開封地區(qū)首例甲型H1N1流感患者的病毒株與北美地區(qū)流行的甲型H1N1流感病毒高度同源，為同一進化分支。

2.4 HA基因變異分析：與以往流行的豬流感病毒對比發(fā)現(xiàn)，決定流感病毒變異的關鍵基因HA基因（1699bp）中有12個堿基發(fā)生了點突變，分別涉及第412位（A→C），第414位（A→U），第436位（C→A），第437位（G→A），第464位（A→G），第465位（G→C），第598位（A→C），第599位（G→U），第826位（G→A），第828位（C→U），第833位（A→C），第834位（G→U）。

圖1 正常的MDCK細胞和接種流感病毒株4 d之后CPE的細胞狀態(tài)圖

3 討 論

自2009年4月中旬全球報告第一例新甲型H1Nl流感確診病例，由于人群普遍的缺乏免疫力，該病毒通過人際傳播迅速波及全球五大洲120余個國家和地區(qū)，成為巨大的公共衛(wèi)生威脅。開封地區(qū)自2009年7月26日出現(xiàn)首例輸入性甲型 H1N1流感確診病例以來，患病人數(shù)急劇增加。到目前為止，全市共采集流感樣病例標本1828例，甲型H1N1流感確診病例達286例，占總樣品數(shù)15.6%。

我們采用MDCK細胞從286例甲型H1N1流感確診病例咽拭子或鼻咽拭子標本中分離甲型H1N1流感病毒，將分離出的首株甲型H1N1流感病毒株，命名為A/Kaifeng/01/2009（H1N1）。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，在相同操作流程和培養(yǎng)條件下MDC K細胞似乎對甲型H1 N1流感病毒比散發(fā)季節(jié)性流感病毒更加敏感：前者第一代多在24 h左右即可觀察到CPE，72～96 h CPE可達+++～++++而后者則多在48h后才能觀察到CPE，96 h左右甚至更長時間CPE才達到+++～++++。

流感病毒通過不斷的基因重排改變其抗原性來逃避宿主特異性免疫的識別，從而不斷引起流行，尤其以HA基因重排引起的HA蛋白抗原決定簇位點的變異最為重要[7]。HA抗原具有免疫原性，能使人體產(chǎn)生保護性抗體[8]；但其容易變異。是流感流行的主要原因之一。導致甲型流感病毒抗原高度易變的主要原因是高發(fā)的點突變率和基因重排[9]。在此次研究中我們將A/Kaifeng/01/2009（H1N1）毒株與以往流行的豬流感病毒株對比發(fā)現(xiàn)，決定流感病毒變異的關鍵基因HA基因（1699bp）中有12個堿基發(fā)生了點突變，突變涉及的基因編碼的氨基酸序列均是HA蛋白重要的抗原位點，又由于HA基因編碼蛋白具有重要的免疫原性，能使人體產(chǎn)生保護性抗體，因此，HA基因的變異直接導致HA蛋白抗原決定簇的氨基酸發(fā)生了變化，在人群普遍易感的情況下，造成了流感大流行。這同時也提示了開封地區(qū)首例病毒分離株A/Kaifeng/01/2009（H1N1）出現(xiàn)了HA蛋白的抗原漂移現(xiàn)象。

此次對開封地區(qū)甲型H1N1流感病毒進行分離鑒定及同源性分析，不但為在河南地區(qū)開展甲型H1N1流感的預防控制工作奠定了研究基礎，且在全面防治甲型H1N1流感病毒的傳播方面也有著極其重要的意義。

[1] Stein RA.Lessons from outbreaks of HI N1 influenza[J].Ann Intern Med,2009,150(1):26.

[2] Garten RJ,Davis CT.Antigenic and genetic characteristics of swine—origin 2009 A(H1 N1) influenza viruses circulating in humans [J].Science,2009,325(5937):197-201.

[3] Munster VJ,de Wit E.Pathogenesis and transmission of swineorigin 2009 A(H1N1)influenza virus in ferrets[J].Science,2009,3 25(5939):481-483

[4] Maines TR,Jayaraman A,Belser JA,et al.Transmission and pathogenesis of swine-origin 2009 A(H1N1)influenza viruses in ferrets and mice[J].Science,2009,325(5939):484-487.

[5] WHO.Sequencing primers and protocol [EB/OL]. http://www.who.Int/csr/resources/publications/swineflu/ GenomePrimers_20090512.pdf.

[6] 郭元吉,程小雯.流行性感冒病毒及其實驗技術[M].北京:中國三峽出版社,1997:185-188.

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[9] Bizebard T,Gigant B.Structure of influenza virus haemagglutinin complexed with a neutralizing antibody[J].Nature,1995,376(6535):92-94.

Isolation, Identification and Homology Analysis of the First Influenza A （H1N1） Virus in A District

CAO Xiao, GONG Biao*, HU Huai-jie, XU Jiao, RAN Ran
(Department of Laboratory, Kaifeng Center for Disease Control and Prevention, Kaifeng 475000, China)

ObjectiveDetection and separation of H1N1 influenza virus, the first area of Kaifeng virus strains were isolated from whole genome sequencing and homology analysis, to provide a scientific basis for the study of influenza virus epidemic and the variation law.MethodsReal-time RT-PCR method for detection, screening to determine the influenza A H1N1 virus positive specimens; using MDCK cells isolated H1N1 influenza virus strain A/Kaifeng/01/2009 (H1N1); measured and analyzed their whole genome sequence; conducted using sequence alignment homology analysis.ResultsH1N1 influenza virus were detected in samples from 1828 were positive for influenza-like illness in 286 copies, the positive rate of 15.6%. The first time the whole strain of H1N1 influenza virus genome sequence and in Kaifeng area. Genome sequence analysis showed that: the strain and 2009 pandemic strain is highly homologous to the same evolutionary branch. Previous epidemic of swine influenza virus strains found in contrast, HA gene 12 bp point mutation occurred.ConclusionMDCK cells (H1N1) virus has a high sensitivity; Kaifeng area first case of H1N1 flu virus strains isolated in North America epidemic strains highly homologous; compared with the previous representative strains of classical swine influenza HA protein antigen appeared drift; lay the foundation for further research in molecular biology (H1N1) virus in the future.

Influenza A (H1N1) virus; Virus isolation; Sequence analysis; Homology

R373.1

B

1671-8194（2014）28-0002-02

開封市科技攻關項目（100369）

*通訊作者