多功能陽離子脂質(zhì)體跨血脊髓屏障的實(shí)驗(yàn)研究

高仕杰 劉 洋

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨科，天津 300052）

多功能陽離子脂質(zhì)體跨血脊髓屏障的實(shí)驗(yàn)研究

高仕杰 劉 洋

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨科，天津 300052）

目的探討異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記陽離子脂質(zhì)體通過尾靜脈注入后，跨越大鼠血脊髓屏障并在局部聚集的情況。方法30只成年Wistar大鼠隨機(jī)等分為3組，每組10只，熒光顯微鏡動態(tài)觀察脂質(zhì)體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中靶向聚集與擴(kuò)散情況，通過組織學(xué)觀測進(jìn)一步分析其與CNS細(xì)胞的關(guān)系。結(jié)果相同濃度下（75～600 μg/mL），TAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體較未經(jīng)TAT修飾者具更低細(xì)胞毒性，且更易被MCF-7細(xì)胞攝?。籉ITC標(biāo)記TAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體可跨越BSCB并聚集，低倍鏡下觀察到許多熒光微粒聚集于CNS組織，高倍鏡形象地顯示出熒光微粒位于神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)。結(jié)論經(jīng)跨膜肽（TAT）、聚乙二醇（PEG）修飾的陽離子脂質(zhì)體具有良好的生物相容性與靶向定位特性，可跨過BSCB，聚集于CNS細(xì)胞中，安全用作藥物載體，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新的途徑。

陽離子脂質(zhì)體；異硫氰酸熒光素；血脊髓屏障

目前，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）疾病的治療仍為醫(yī)學(xué)界面臨的一大難題，藥物依然是治療此類疾病最為可靠的方法[1-2]。然而，由于血脊髓與血腦屏障中內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的存在，大分子藥物很難通過，限制了其發(fā)揮有效作用。許多研究探討過解決此問題的方法[3-8]，但無一結(jié)果令人滿意。因此，我們需要尋找一類更為有效的藥物運(yùn)載方式。脂質(zhì)體作為一種納米載體，能夠擴(kuò)散至內(nèi)皮細(xì)胞膜內(nèi)，并依靠被動運(yùn)輸進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。而單純脂質(zhì)體水溶性低，需要對其進(jìn)行進(jìn)一步修飾。

研究表明，表面連接TAT可增強(qiáng)脂質(zhì)體跨越血腦屏障的能力。有學(xué)者已證明了經(jīng)TAT修飾的微粒能夠攜帶抗生素經(jīng)過血腦屏障以治療急性細(xì)菌性腦炎[9-10]。本實(shí)驗(yàn)使用FITC標(biāo)記制備的TAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體，使其兼具跨膜、長循環(huán)及熒光示蹤功能，經(jīng)尾靜脈將其注入大鼠體內(nèi)，旨在分析此新型脂質(zhì)體跨越血脊髓、血腦屏障的能力，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：健康成年雄性Wistar大鼠30只（8周齡），體質(zhì)量（220±10）g，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所提供。

1.1.2 主要儀器：眼科手術(shù)器械（新華手術(shù)器械廠），熒光顯微鏡（OLYMPUS BX-60，Japan），透射電子顯微鏡（JEOL-100CXII，日本電子光學(xué)公司），激光粒度分析儀及zeta電位分析儀（Malvern Instruments Ltd.，U.K.），電子天平（JA-2003，上海），切片機(jī)（LEUCER，USA）。

1.1.3 主要試劑：PEG-陽離子脂質(zhì)體、TAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體、FITCTAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體（天津大學(xué)材料學(xué)院納米生物技術(shù)研究所），高糖DMEM培養(yǎng)液（Solarbio公司，天津鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司代理）、胎牛血清（GIBCO公司，USA）：將上述兩種試劑按9∶1配制成含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液作為培養(yǎng)基供MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)用，MTT（四甲基偶氮唑鹽）（Genview公司）：用0.01 mol/L PBS（pH 7.0）配成5 mg/mL，4 ℃避光保存，二甲基亞砜（天津市化學(xué)試劑三廠，分析純）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物飼養(yǎng)：于溫度20～23 ℃，濕度50%～70%，照度200勒克斯（12-h light and 12-h dark cycle），噪音60分貝，通風(fēng)條件（10～15次/小時(shí)）下飼養(yǎng)動物，自由進(jìn)食水。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：MCF-7人乳腺癌細(xì)胞（南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供）在含12%新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、95%濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中。每1～2 d換液1次，每2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 FITC -TAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體的測定：通過透射電子顯微鏡觀察FITC-TAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體的形態(tài)學(xué)特征；平均粒徑、粒徑分布與zeta電位通過激光粒度分析儀及zeta電位分析儀進(jìn)行分析。

1.2.4 脂質(zhì)體體外毒性試驗(yàn)：胰酶消化對數(shù)期MCF-7細(xì)胞，終止后離心收集，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整其濃度至（5～10）×104/mL。接種于96孔板，1次加6孔，每孔100 μL（邊緣孔用無菌PBS填充）。將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中，5%CO2、37 ℃孵育，貼壁生長約24 h，至細(xì)胞單層鋪滿孔底。加入不同濃度梯度藥物，每孔100 μL，每個(gè)梯度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。5%CO2、37 ℃孵育4、12、24、48 h。而后每孔加入20 μLMTT溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT），5%CO2、37 ℃孵育培養(yǎng)4 h，濾紙吸去上清，溶解結(jié)晶。無菌0.01 mol/L PBS洗1～2次。每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570 nm處測量各孔的吸光值，用620 nm作參考波長。計(jì)算各濃度細(xì)胞存活率，公式如下：細(xì)胞存活率%=（實(shí)驗(yàn)孔OD值-調(diào)零孔OD值）/（對照孔OD值-調(diào)零孔OD值）×100%。

1.2.5 細(xì)胞攝取脂質(zhì)體情況分析：將MCF-7細(xì)胞接種于6孔板上（密度1 ×104/孔）。一天后，分別加入FITC-TAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體、FITCPEG-陽離子脂質(zhì)體及FIFC懸液。于5 s，10 s，4 min，30 min，1 h，24 h后，分別移去介質(zhì)，PBS液（0.01mol/L）漂洗2次，每次5 s。而后使用熒光封固劑將蓋玻片固定于清潔載玻片上，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。同時(shí)，將細(xì)胞置于PBS液中（20 μg/mL）進(jìn)行PI染色以觀察細(xì)胞核形態(tài)。

1.2.6 CNS攝取脂質(zhì)體的體內(nèi)分析：將30只成年Wistar大鼠隨機(jī)等分為3組：單純FIFC懸液對照組（A組）、FITC-PEG-陽離子脂質(zhì)體組（B組）、FITC-TAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體組（C組），每組10只，均通過尾靜脈將溶液注射于大鼠體內(nèi)，劑量為4.55 mg/kg。注射后第1、4、8、12及24 h，分別以10%水合氯醛腹腔注射處死大鼠，快速取出其腦與脊髓組織存于液氮中。隨后，將組織置于-80 ℃條件下24 h，而后置于-20 ℃環(huán)境中。制作大腦與脊髓前后軸的冠狀位冰凍切片（厚度10 mm），使用包含DAPI的熒光封固劑將其固定于玻片上以進(jìn)行細(xì)胞核染色。使用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本。

1.2.7 組織學(xué)分析：制作中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織冰凍切片（厚度30 mm），PBS液漂洗，使用包含PI的熒光封固劑將其固定于玻片上以進(jìn)行細(xì)胞核染色。同時(shí)，制作厚度為5 mm冰凍切片進(jìn)行HE染色。使用熒光顯微鏡與光學(xué)顯微鏡觀察標(biāo)本。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（χ-±s）的形式表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS公司，美國）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 脂質(zhì)體平均粒徑、粒徑分布與zeta電位值：利用反相蒸發(fā)法制備的FITC-TAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體見圖1～3?？梢婈栯x子脂質(zhì)體分散性較好，呈球形，粒徑多在100 nm以下。粒度分析儀測得的平均粒徑為85.9 nm，粒徑分布范圍在80～100 nm，粒徑分布指數(shù)為0.179（圖4a）。zeta電位值為（29.57±3.47）mV（圖4b）。

2.2 細(xì)胞毒性比較：MCF-7細(xì)胞與不同濃度的脂質(zhì)體共培養(yǎng)4、12、24、48 h后，生存率見圖5、表1。與600 μg/mL濃度的TAT-PEG-脂質(zhì)體共培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞存活率為（61.84±3.34）%，而與PEG-脂質(zhì)體共培養(yǎng)細(xì)胞存活率<50%。細(xì)胞存活率隨脂質(zhì)體濃度的增加而逐漸降低。

2.3 細(xì)胞攝取脂質(zhì)體情況：MCF-7細(xì)胞與FITC-TAT-PEG-脂質(zhì)體共培養(yǎng)一段時(shí)間后，可在胞內(nèi)觀察到密集熒光。TAT-PEG-脂質(zhì)體跨膜典型的時(shí)間依賴性見圖6、7。5 s后，F(xiàn)ITC-TAT-PEG-脂質(zhì)體組、FITC-PEG-脂質(zhì)體組中細(xì)胞膜周圍出現(xiàn)熒光。10 s后，熒光更為明顯，然而，大部分仍位于細(xì)胞膜外而未進(jìn)入胞內(nèi)。3＇30＂后FITC-TAT-PEG-脂質(zhì)體組的胞膜與胞質(zhì)中均可觀測到熒光。4 min后，熒光出現(xiàn)于細(xì)胞內(nèi)，但仍位于細(xì)胞核外。1 h后（1～24 h）熒光均位于細(xì)胞內(nèi)，兩組分布無差別。

2.4 CNS中脂質(zhì)體聚集情況：于尾靜脈注射4 h后發(fā)現(xiàn)，較脊髓與腦組織中其他區(qū)域，熒光更多集中于毛細(xì)血管，表明脂質(zhì)體由毛細(xì)血管進(jìn)入周圍組織（圖9a1、b1）。此外，由于灰質(zhì)血供豐富，脂質(zhì)體主要聚集于此，白質(zhì)中幾乎沒有出現(xiàn)（圖9c1、d1）。低倍鏡下可觀察到許多熒光微粒聚集于CNS組織；高倍鏡亦可形象顯示出熒光微粒位于神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)（圖8，白色箭頭）。通過比較HE與熒光染色，可知CNS中熒光微粒與細(xì)胞的關(guān)系（圖9），相同結(jié)果亦在注射1 h與24 h后觀察到，這很大程度上取決于PEG的長時(shí)間循環(huán)特性。

圖1 反向蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體流程圖

圖2 FIFC-TAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)示意圖

圖3 FIFC-TAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體透射電鏡圖，可見該脂質(zhì)體呈球形，粒徑分布較均勻，脂質(zhì)體粒徑＜100 nm

圖4 FIFC-TAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體粒徑分布及zeta電位值，有效粒徑大小約為85.9 nm（a），平均電位在（29.57± 3.47）mV，具有較好的分散性及穩(wěn)定性

圖5 與脂質(zhì)體共培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞生存率，圖a示與非TAT修飾脂質(zhì)體共培養(yǎng)4、12、24、48 h后MCF-7細(xì)胞體外生存率；圖b示與TAT修飾脂質(zhì)體共培養(yǎng)4、12、24、48 h后MCF-7細(xì)胞體外生存率

圖6 熒光顯微鏡下觀察MCF-7細(xì)胞與FITC-TAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體、FITC-PEG-陽離子脂質(zhì)體、單純FITC共培養(yǎng)情況分別如圖a、b、c所示

圖7 37 ℃下，與FITC-TAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體共培養(yǎng)24 h，高倍鏡觀察MCF-7細(xì)胞如圖所示，細(xì)胞核經(jīng)PI染色，圖a為FITC熒光細(xì)胞顯像，圖b為PI染色后細(xì)胞核顯像，圖c為a、b重疊像

圖8 大鼠尾靜脈注射FITC-TAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體4 h后，脊髓與腦組織冰凍切片經(jīng)熒光顯微鏡（a）、亮場顯微鏡（b）觀察結(jié)果如圖所示,c為a、b重疊像，箭頭示熒光微粒聚集于脊髓和腦組織神經(jīng)細(xì)胞中

3 討 論

脂質(zhì)體與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜產(chǎn)生靜電作用而導(dǎo)致細(xì)胞毒性，這與其數(shù)量、濃度、陽離子分布相關(guān)。聚合物相對分子質(zhì)量和電荷密度的增加會造成細(xì)胞膜的損傷，甚至細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)用MTT法檢測MCF-7細(xì)胞與脂質(zhì)體共培養(yǎng)后的存活率，該法簡便、快速，且能較客觀地反映細(xì)胞相對存活情況，在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用廣泛。結(jié)果顯示，與低密度TAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體共培養(yǎng)的細(xì)胞具有較高生存率，表明新型脂質(zhì)體具有良好的生物相容性，在相對安全劑量范圍內(nèi)（75 μg/mL）并不影響細(xì)胞存活率，故新型脂質(zhì)體可安全用作藥物載體。分析其原因，主要是因?yàn)門AT修飾的脂質(zhì)體以更多數(shù)量迅速進(jìn)入MCF-7細(xì)胞內(nèi)，減少了帶正電荷的脂質(zhì)體在細(xì)胞外的蓄積。未經(jīng)TAT修飾的脂質(zhì)體只有較少量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成過多正電荷在胞外蓄積。

表1 與不同濃度脂質(zhì)體體外共培養(yǎng)不同時(shí)間后MCF-7細(xì)胞生存率（n=10）

圖9 大鼠尾靜脈注射FITC-TAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體4 h后，高倍鏡觀察CNS神經(jīng)細(xì)胞中熒光微粒分布如圖所示，細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色

最近研究表明[11-13]，TAT通過巨胞飲，一種內(nèi)吞形式完成內(nèi)化過程，為此類多肽的研究提供了新的依據(jù)。TAT介導(dǎo)的內(nèi)化過程主要包含三個(gè)步驟：首先為依靠細(xì)胞表面廣泛存在的多糖鏈與胞體表面結(jié)合；而后TAT可能通過結(jié)合細(xì)胞表面蛋白或蛋白聚糖、糖脂途徑激活巨胞飲作用[14]，與細(xì)胞表面陰離子多聚糖鏈，如硫酸肝素結(jié)合，在內(nèi)化過程中起著關(guān)鍵作用，這種結(jié)合可促進(jìn)其進(jìn)入巨胞飲體；最后從巨胞飲體中脫出進(jìn)入胞質(zhì)，這很大程度上依賴于胞內(nèi)PH值，TAT干擾了膜的穩(wěn)定性，從而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。

FITC是一種常用的綠色熒光探針，是目前應(yīng)用最廣泛的熒光素。本實(shí)驗(yàn)用FITC標(biāo)記TAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體，可清晰顯示其在MCF-7細(xì)胞內(nèi)外的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FITC-TAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體較未經(jīng)TAT修飾者能夠更快、更有效地進(jìn)入MCF-7細(xì)胞中。由此可知，TAT具有促進(jìn)細(xì)胞攝入脂質(zhì)體的功能，F(xiàn)ITC-TAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體可以有效結(jié)合于MCF-7細(xì)胞表面并進(jìn)入胞內(nèi)。而且細(xì)胞熒光顯像發(fā)現(xiàn)，TAT介導(dǎo)的陽離子脂質(zhì)體不僅進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，而且進(jìn)入細(xì)胞核，這就為基因轉(zhuǎn)染提供了較多可能性。

實(shí)驗(yàn)中，在尾靜脈注射脂質(zhì)體后1～24 h區(qū)間內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組可在CNS神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)及其周圍觀測到熒光，這說明FITC-TAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體不僅能跨過血脊髓屏障與血腦屏障，而且能夠穿越細(xì)胞之間的組織到達(dá)臨近細(xì)胞，這與我們之前所做FITC-TAT-PEG-陽離子脂質(zhì)體與MCF-7細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。實(shí)驗(yàn)也證明未經(jīng)TAT修飾的脂質(zhì)體跨CNS屏障能力有限，單純FITC不能跨過血脊髓、血腦屏障。原始脂質(zhì)體依被動擴(kuò)散跨血脊髓、血腦屏障，此機(jī)制受CNS損傷處的多種條件限制，如pH值、顆粒直徑、相對分子質(zhì)量等。將PEG包繞于脂質(zhì)體表面，可減少血漿蛋白的黏附作用，避免單核巨噬細(xì)胞對脂質(zhì)體的快速識別[15]，減少RES攝入，延長其循環(huán)時(shí)間。作為跨膜肽，TAT能夠誘導(dǎo)內(nèi)吞泡的形成，并通過類似AMT機(jī)制引起質(zhì)膜的內(nèi)吞作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，將PEG、TAT與脂質(zhì)體相結(jié)合，能夠使其最大程度地跨越血脊髓、血腦屏障并聚集于受損局部，以更為有效地發(fā)揮所承載藥物的作用，使之有望成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的有力工具。

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Fitc Loaded Tat-Peg-Modified Liposomes Cross the Blood-Spinal Cord and the Blood-Brain Barriers

GAO Shi-jie, LIU Yang
(Department of Orthopaedics, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China)

ObjectiveTo observe the ability of fluorescein isothiocyanate(FITC) loaded transactivating-transduction protein(TAT)-polyethylene glycol(PEG)-modified liposomes crossing the blood-spinal cord barrier(BSCB) of rats, then localizing there after injection of caudal veins.MethodThirty rats were divided into three groups. Rats were injected with liposome solution (4.55 mg/kg) via the caudal vein. Using fluorescence microscope and histological methods to analyse.ResultsAt the same concentration(75-600 μg/mL), TAT-modified liposomes had lower cytotoxicity, and were more easily uptaken by MCF-7 cells than the ones without TAT. We observed that TAT-modified liposomes crossed the BSCB, accumulated in CNS tissue and aggregated into cells there by microscope.ConclusionTAT-PEG-modified liposomes have the characteristics of bio-compatibility and targeting. They can cross the BSCB acting as a drug carrier and accumulate in CNS tissue for future CNS disease treatment.

Liposome; Fluorescein isothiocyanate(FITC); Blood-spinal cord barrier(BSCB)

R741.04

B

1671-8194（2014）34-0045-03