整合素連接激酶在大鼠阿霉素腎病模型中的表達(dá)

賀德剛* 楊曉萍

（1 廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院杏林分院內(nèi)科，福建 廈門 361000；2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎病科，新疆 石河子 832008）

整合素連接激酶在大鼠阿霉素腎病模型中的表達(dá)

賀德剛1* 楊曉萍2

（1 廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院杏林分院內(nèi)科，福建 廈門 361000；2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎病科，新疆 石河子 832008）

目的動(dòng)態(tài)觀察大鼠阿霉素腎病模型中整合素連接激酶（ILK）的表達(dá)變化，探討其與腎小球疾病的關(guān)系。方法用尾靜脈注射阿霉素建模，用光鏡、電鏡觀察腎臟病理改變，免疫熒光觀察ILK在不同時(shí)間點(diǎn)模型組腎組織的表達(dá)改變。結(jié)果①與對(duì)照組比，前4周，模型組24 h尿蛋白量7 d增加，21 d達(dá)高峰（P＜0.01）；后8周，模型組24 h尿蛋白量逐漸減少，84 d降到最低值（P＜0.01）；②與對(duì)照組比，前4周，模型組腎小球ILK的表達(dá)7 d減少，14 d明顯增加（P＜0.05）；后8周，模型組ILK表達(dá)逐漸減少（P＜0.05）；③電鏡顯示：前4周模型組大鼠足細(xì)胞足突廣泛融合；后8周，模型組足細(xì)胞病變進(jìn)一步加重，出現(xiàn)了其與基底膜的分離、脫落；④足細(xì)胞ILK表達(dá)的變化與模型組24 h尿蛋白定量的變化呈正相關(guān)（r=0.897，P＜0.01）。結(jié)論①ILK早期出現(xiàn)表達(dá)增加及分布異常，可能是導(dǎo)致蛋白尿的原因及判斷腎小球足細(xì)胞損傷的一個(gè)早期重要指標(biāo)。②ILK與蛋白尿呈正相關(guān)，其在腎組織中表達(dá)的高低對(duì)腎臟疾預(yù)后的判斷具有一定意義。

阿霉素；蛋白尿；ILK

目前，足細(xì)胞損傷的研究已成為探索腎小球疾病發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)。足細(xì)胞是腎臟的固有細(xì)胞之一，是腎小球?yàn)V過屏障重要組成部分，它在蛋白尿的產(chǎn)生中作用尤為重要。而整合素連接激酶（integrin-linked kinase，ILK）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等中都起重要作用。近年來研究表明ILK在腎小球足細(xì)胞中表達(dá)水平較高，在維持腎小球基底膜的完整性、介導(dǎo)足細(xì)胞與腎小球基底膜黏附、基底膜結(jié)構(gòu)和足細(xì)胞功能方面發(fā)揮重要作用[1-2]。此實(shí)驗(yàn)用一次性尾靜脈注射鹽酸阿霉素的方法建立大鼠阿霉素腎病模型，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)大鼠尿蛋白的量，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)和電鏡觀察ILK在不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腎組織中的表達(dá)情況，探討在阿霉素腎病模型中ILK的表達(dá)變化與蛋白尿發(fā)生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑：雄性清潔級(jí)SD大鼠84只，體質(zhì)量180～220 g（新疆流行病研究所）。阿霉素（深圳萬樂藥業(yè)有限公司）；兔抗ILK抗體（Santa Cruz公司）；羅丹明標(biāo)記羊抗兔抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.2 動(dòng)物模型的制備：將SD大鼠隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組、模型組各42只，采用尾靜脈注射阿霉素（濃度2 mg/mL，7.5 mg/kg劑量），建立阿霉素腎病模型，對(duì)照組大鼠尾靜脈注射等體積生理鹽水[3]。

1.3 大鼠標(biāo)本收集、檢測(cè)：兩組大鼠于建模后第7、14、21、28、42、56、84 d處死，每組各6只。宰殺前1 d用代謝籠留取24 h尿液，宰殺前通過內(nèi)眥靜脈采血，留取大鼠腎臟組織進(jìn)行病理檢測(cè)。

1.4 腎臟病理觀察：①標(biāo)本大體觀察；②光鏡觀察：腎臟經(jīng)福爾馬林固定，石蠟包埋切片，HE、Masson、PAS染色觀察。③電鏡觀察：留取腎皮質(zhì)組織塊約1 mm3，經(jīng)戊二醛固定、鋨酸后固定、脫水、環(huán)氧樹脂618包埋，超薄切片后醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，電鏡觀察。

1.5 腎小球ILK免疫熒光染色及定量分析：大鼠的腎組織經(jīng)液氮冰凍包埋，在-20 ℃恒冷冰凍切片機(jī)以3 μm厚度連續(xù)切片，-20 ℃凍存，37 ℃干燥，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，PBS沖洗，10%正常山羊血清封閉1 h，用一抗（抗ILK抗體）在4 ℃孵育過夜，PBS沖洗，再用二抗（羅丹明標(biāo)記的抗-兔IgG）在37 ℃孵育1 h，PBS沖洗，DAPI封片。用PBS代替一抗作空白對(duì)照。用激光共聚焦掃描顯微鏡（德國(guó)ZEISS公司ISM510型）進(jìn)行單盲讀片，每個(gè)標(biāo)本均采集3個(gè)腎小球進(jìn)行分析。各觀察標(biāo)本的表達(dá)量用Zeiss LSM多功能真彩色圖像分析系統(tǒng)測(cè)定腎小球中ILK的平均吸光度值。若信號(hào)分布不均勻或節(jié)段消失，則視為表達(dá)部分缺失，ILK蛋白部分脫落；若陽(yáng)性信號(hào)分布均勻、連續(xù)，視為表達(dá)完整，ILK蛋白存在。

表1 兩組大鼠各時(shí)間點(diǎn)24 h尿蛋白量（mg/24 h）

表1 兩組大鼠各時(shí)間點(diǎn)24 h尿蛋白量（mg/24 h）

表2 兩組大鼠各時(shí)間點(diǎn)ILK免疫熒光半定量分析

表2 兩組大鼠各時(shí)間點(diǎn)ILK免疫熒光半定量分析

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：各項(xiàng)指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組比較時(shí)，若方差齊則采用單因素方差分析；若方差不齊則采用秩和檢驗(yàn)。用Spearman相關(guān)分析方法作指標(biāo)相關(guān)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腎小球的病理形態(tài)觀察：光鏡、電鏡觀察對(duì)照組腎小球的結(jié)構(gòu)正常，足細(xì)胞的足突形態(tài)正常，無融合或消失，足細(xì)胞無脫落。模型組腎小球于第14天可見足細(xì)胞足突的形態(tài)變化，部分腫脹、融合，系膜細(xì)胞稍增多。于第42天，足細(xì)胞足突融合或消失明顯，部分基底膜裸露，系膜細(xì)胞增生，部分腎小球毛細(xì)血管襻出現(xiàn)階段性硬化伴腎小管萎縮，系膜基質(zhì)增生；第84天，足細(xì)胞脫落、消失，腎小球局灶節(jié)段性硬化明顯，腎小管萎縮，系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)明顯增生，出現(xiàn)FSGS典型病理改變。

2.2 尿蛋白的變化：兩組大鼠24小時(shí)尿蛋白數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析見表1，結(jié)果顯示：模型組24 h尿蛋白定量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。前4周為微小病變階段，模型組24小時(shí)尿蛋白從第7天開始增加，于第21天達(dá)到高峰，均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。后8周為局灶階段性硬化階段，模型組24 h尿蛋白定量從第42天開始減少，于第84天減到最低，均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 腎臟ILK表達(dá)定位分布、熒光形態(tài)計(jì)量：熒光顯微鏡下觀察到ILK蛋白在腎小球的定位分布規(guī)律，對(duì)照組ILK沿腎小球基底膜上皮細(xì)胞側(cè)連續(xù)均勻分布，呈線型熒光。模型組可見ILK表達(dá)呈點(diǎn)狀或短線狀，基底膜熒光有節(jié)段性缺失。

大鼠腎小球ILK表達(dá)熒光的形態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析見表2，結(jié)果顯示：前4周，模型組腎小球中的ILK表達(dá)量在第7天有所減少，但隨著時(shí)間的發(fā)展，模型組腎小球中的ILK表達(dá)量在第14天出現(xiàn)增加，第21天達(dá)到最大值，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。后8周為局灶階段性硬化階段，模型組ILK的熒光表達(dá)量從第42天開始減少，于第84天減到最低，均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 相關(guān)分析：模型組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎小球中ILK的表達(dá)量與24 h尿蛋白量之間呈正相關(guān)（r=0.897，F(xiàn)=165.528，P＜0.01）。

3 討 論

許多腎臟疾病的主要臨床特征表現(xiàn)為蛋白尿，近年來關(guān)于蛋白尿的研究多以足細(xì)胞或裂孔隔膜相關(guān)蛋白為重點(diǎn)，通過對(duì)多種足細(xì)胞特異性蛋白分子（nephrin、podocin、P-選擇素等）的研究，在蛋白尿的產(chǎn)生方面取得重大進(jìn)展[4-5]。而在足細(xì)胞中表達(dá)水平較高ILK，是1996年發(fā)現(xiàn)的一種新的黏附蛋白，屬絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，在進(jìn)化上高度保守。已有研究顯示它與腎臟上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化、系膜細(xì)胞增殖和系膜基質(zhì)沉積等過程關(guān)系密切。新近研究表明ILK主要以外周方式存在于腎小球，在足細(xì)胞呈強(qiáng)染色，對(duì)保持腎小球的濾過功能、維持腎小球基底膜的完整性和防止蛋白質(zhì)的漏出有重要意義[6-8]。

本文用一次性尾靜脈注射阿霉素的方法復(fù)制腎病模型，表現(xiàn)為病變的兩個(gè)階段。在前四周，表現(xiàn)為大量蛋白尿、低蛋白血癥，與原發(fā)性微小病變腎病相似。實(shí)驗(yàn)中通過免疫熒光觀察到對(duì)照組腎臟組織中ILK在腎小球的足細(xì)胞明顯表達(dá)，這與文獻(xiàn)的報(bào)道一致[6]。在腎病模型前四周，建立的早期（7 d），模型組大鼠出現(xiàn)蛋白尿、低蛋白血癥，而此時(shí)模型組大鼠腎小球ILK的熒光表達(dá)量首先下降，可能為阿霉素及其代謝產(chǎn)物造成足細(xì)胞損傷所致，但隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組腎小球中出現(xiàn)ILK表達(dá)量的增加，并于第21天時(shí)達(dá)最高值，而同時(shí)檢測(cè)到模型組大鼠尿蛋白的量進(jìn)一步增加，血漿白蛋白進(jìn)一步下降。分析其原因，此實(shí)驗(yàn)阿霉素腎病的主要病變部位是腎小球的足細(xì)胞，而足細(xì)胞具有高度分化、增生能力有限的特點(diǎn)[9-10]。在兒童先天性腎病綜合征芬蘭型（CNF），Kretzler等[11]觀察到CNF的腎小球足細(xì)胞ILKmRNA水平增高，在小鼠腎毒性腎炎模型中，足細(xì)胞ILK表達(dá)增高亦引起足細(xì)胞表型改變，與基底膜黏附減少，從基底膜脫落，導(dǎo)致嚴(yán)重蛋白尿。Teixeira等[12]發(fā)現(xiàn)當(dāng)腎小球足細(xì)胞中ILK活性增加時(shí)，可調(diào)節(jié)整合素的活性和親和力，也引起足突細(xì)胞表型改變、足突消失，干擾其與基質(zhì)的相互作用，使其與腎小球GBM分離、增殖，同時(shí)伴有細(xì)胞骨架的紊亂，抑制裂孔膜表面的P鈣黏蛋白和CD2AP分子的表達(dá)，從而導(dǎo)致腎小球?yàn)V過膜的損傷和嚴(yán)重蛋白尿。在此阿霉素腎病模型中，足細(xì)胞ILK的表達(dá)發(fā)生了變化，出現(xiàn)了分布異常，免疫熒光結(jié)果顯示ILK的分布從沿著腎小球基底膜線樣分布逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)椴贿B續(xù)性顆粒樣或節(jié)段性斑片狀分布，電鏡顯示模型組大鼠出現(xiàn)足細(xì)胞足突的腫脹、融合、消失，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展ILK表達(dá)量在21 d出現(xiàn)最高值，而此時(shí)蛋白尿也明顯增多，相關(guān)性分析顯示模型組腎小球不同時(shí)間ILK表達(dá)量與24 h尿蛋白量成正相關(guān)（r=0.897，F(xiàn)=165.528，P＜0.01）。由此推斷ILK介導(dǎo)足細(xì)胞與腎小球基底膜的黏附和蛋白尿的發(fā)生。而且通過此實(shí)驗(yàn)觀察到ILK的表達(dá)變化早于足細(xì)胞損傷和蛋白尿的產(chǎn)生，依次分析ILK可能是判定足細(xì)胞損傷和蛋白尿的一個(gè)早期指標(biāo)。

在阿霉素腎病模型后6周，表現(xiàn)為腎小球的局灶性、階段性硬化，腎小管的萎縮，復(fù)制了局灶階段性腎小球硬化模型。但隨著造模時(shí)間的推移，大鼠腎小球中出現(xiàn)ILK表達(dá)量減少，模型組大鼠尿蛋白的量也進(jìn)一步減少，并于第84天時(shí)達(dá)最低值。已有研究表明，在一些伴有大量蛋白尿的腎小球疾病中，可以觀察到足細(xì)胞數(shù)量的減少。足細(xì)胞數(shù)量減少的原因有：凋亡、脫落、增殖有限、表型轉(zhuǎn)變[13]。在此模型的后6周，我們觀察到部分腎小球基底膜的增厚，部分基底膜裸露，足細(xì)胞數(shù)量減少，脫落或消失。Asanuma等[14]研究認(rèn)為TGF-β1、bFGF 、PDGF等生長(zhǎng)因子可以導(dǎo)致局部蛋白酶及其抑制劑的分泌不平衡，蛋白水解活性增加誘導(dǎo)GBM退化，造成足細(xì)胞和基底膜連接的損害，啟動(dòng)足細(xì)胞從GBM脫落。Teixeira等[12]研究表明ILK還能促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶-2，9的分泌，該酶又可導(dǎo)致基底膜的降解，使基底膜完整性受到破壞而產(chǎn)生蛋白尿。在糖尿病腎病患者的腎組織中，Guo等[15]發(fā)現(xiàn)ILK在系膜細(xì)胞表達(dá)顯著增加，與系膜細(xì)胞彌漫擴(kuò)張相關(guān)，而在球性硬化和結(jié)節(jié)性硬化顯著部位，ILK表達(dá)減少。在此模型的后6周，損傷進(jìn)一步加重，出現(xiàn)腎小球的局灶、階段硬化，熒光定量顯示ILK表達(dá)的進(jìn)一步減少，呈節(jié)段性斑片狀分布，電鏡顯示模型組大鼠足細(xì)胞的足突病變進(jìn)一步加重，足細(xì)胞失去代償能力，同時(shí)出現(xiàn)了足細(xì)胞與基底膜的分離、脫落，腎小球基底膜的降解，模型組大鼠的蛋白尿逐漸減少。依次推斷ILK的表達(dá)變化與足細(xì)胞的損傷密不可分，與蛋白尿的產(chǎn)生息息相關(guān)，但足細(xì)胞凋亡此實(shí)驗(yàn)未觀察到，什么時(shí)候啟動(dòng)腎小球硬化，是否只有ILK參與啟動(dòng)腎小球硬化尚未明確。通過次實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了ILK與阿霉素腎病蛋白尿的產(chǎn)生之間具有一定的相關(guān)性，它可能直接或間接地影響了足細(xì)胞的功能狀態(tài)，引起濾過屏障受損，導(dǎo)致蛋白尿，但其作用方式和具體途徑還有待進(jìn)一步研究。

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Expression of Integrin-Linked Kinase in Rat Model of Adriamycin Nephrosis*

HE De-gang1*, YANG Xiao-ping2
(1 Department of Internal Medicine, the Frist Affilicated Hospital of Xinglin Hospital Branch of Medical College of Xiamen University, Xiamen 361000, China; 2 Department of Nephrology, the Frist Affilicated Hospital of Shihezi University School of Medicine, Shihezi 832008, China)

ObjectiveTo dynamically observe the expression of ILK in rat model of adriamycin nephrosis, and to explore the possible relation between it and renal glomerular disease.MethodsThe model of adriamycin nephrosis was established by injection with adriamycin via tail-vein for one time, the kidney tissues at different time rats were studied using electronic microscope and immunofluorescence.Results①Compared with the control group, during the first four weeks, 24 h urine protein excretion in the model group was gradually elevated during the frist 7 days and reached its peak on the 21st day (P<0.01). During the later eight weeks, 24 h urine protein of rats in the model group gradually decreased and reached a minimum value during on the 84th day. ②Compared with the control group, during the first four weeks, the expression of ILK was significantly down-regulated with the progression of proteinuria, and elevated and reached its peak during the frist 14 days (P<0.05). After eight weeks, the expression of ILK decreased gradually(P<0.05). ③During the first four weeks,the foot process fusion was seen on the seventh and fourteenth days with electronic microscope. After eight weeks, podocyte lesion of rats in model group further aggravating, appeared to be separated from podocyte and basement membrane. ④The expression of ILK was positively correlated wiIh the amount of 24 h urinary protein(r=0.897, P<0.01).Conclusions①ILK presents early over-expression and abnormal distribution, possibly suggesting a cause of proteinuria occurrence and an important early indicator for acute podocyte injury. ②ILK was positively associated with proteinuria and its renal tissue expression has a certain significance for the judgment on and kidney disease prognosis.

Adriamycin; Proteinuria; ILK

R692

B

1671-8194（2014）34-0005-03

石河子大學(xué)聯(lián)合基金項(xiàng)目（編號(hào)：LHJJ2010B09）

*通訊作者：E-mail： hedegang@126.com