TGF-β1/Smad信號通路在皮膚病理性瘢痕及瘢痕癌組織中的變化*

劉進輝，李明華，白曉龍，李宏偉，宋 斌

(吉林省人民醫(yī)院燒傷整形科，吉林 長春 130021)

皮膚瘢痕的形成是由于機體炎癥反應(yīng)，膠原的合成與降解不平衡、異常粘多糖的出現(xiàn)以及纖維細胞的增生所造成。從廣義上來講，沒有疤痕就沒有創(chuàng)傷的愈合。疤痕組織的主要成分是纖維蛋白。疤痕組織膠原的產(chǎn)生和沉積增加了傷口的強度，從一般意義上來說是有益的。如果疤痕組織形成不充分，受損組織得不到正常的張力，由此可以引發(fā)許多并發(fā)癥，如腹壁切口愈合的疤痕薄弱，在腹內(nèi)壓的作用下可使疤痕處重新裂開或腹內(nèi)容物逐漸向外膨出而形成腹壁疝。相反，如果疤痕過度形成，就可造成嚴重的外形或功能上的重要問題。因而疤痕相對于損傷前組織來說，總是一個不完善的替換。從機械角度來看，其抗強性減弱;從營養(yǎng)角度來看，造成了氧和營養(yǎng)物質(zhì)交流的障礙;從功能角度看，引起受損組織的畸形和功能障礙，從美觀角度看，造成了外形的破壞。部分病理性瘢痕具有增殖性，其呈現(xiàn)持續(xù)生長亢奮表現(xiàn)，患者可出現(xiàn)瘙癢難忍甚至疼痛破潰出血等癥狀，病理性瘢痕不但影響患者的美觀、生理功能，且在長期受壓、持重、牽拉、摩擦、抓癢等不良刺激影響下有癌變可能［1-3］。

創(chuàng)傷傷口愈合經(jīng)過上皮化環(huán)節(jié)后，TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在成纖維細胞內(nèi)被激活，使體內(nèi)合成和分泌更多的TGF-β1受體，靶基因被持續(xù)性啟動，又由于TGF-β信號傳導(dǎo)通路與細胞基質(zhì)沉淀以及纖維化密切相關(guān)，通路被過度激活后導(dǎo)致細胞外基質(zhì)被過度沉淀，最終形成疤痕。在TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上Smad是該通路中藥的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，可將TGF-β信號從細胞表面受體傳導(dǎo)至細胞核，筆者現(xiàn)將不同瘢痕組織標本進行TGF-β1/Smad信號通路標志性因子蛋白和基因的檢測，以期為瘢痕癌治療提供新的臨床思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料：標本來源于本院2009年1月至2013年2月病理科。20份病理性瘢痕組織標本設(shè)為觀察A組，其中男性11例，女性9例，年齡29-81歲，平均(42±5.32)歲，來源部位：頭面部9例，上肢6例，下肢5例，均有疤痕形成史。20份標本均經(jīng)過HE染色及光鏡檢查確診為瘢痕癌;20份瘢痕癌組織標本設(shè)為觀察B組，其中男性10例，女性10例，年齡30-81歲，平均(42±7.11)歲，來源部位：頭面部8例，上肢7例，下肢4例，臀部1例，疤痕形成原因：火燒傷11例，電擊2例，油燙傷7例;20份正常皮膚組織設(shè)為對照組，其中男性11例，女性9例，年齡31-82歲，平均(43±6.91)歲，部位：頭面部7例，上肢8例，下肢3例，臀部2例。三組標本在年齡、性別、來源部位等一般情況無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 檢測方法

1.2.1 免疫組化

1.2.1.1 標本制作：采用SP法進行標本形態(tài)學(xué)的檢測，標本脫蠟、水化后使用PBS洗2-3次各5min，將3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室溫靜置10min，PBS洗2-3次各5min;抗原修復(fù);PBS洗2-3次各5min;滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min。甩去多余液體。滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1h或者4℃過夜或者37℃1h。4℃過夜后需在37℃復(fù)溫45min。PBS洗3次各5min;滴加Ⅱ抗40-50μl，室溫靜置，或37℃1h;Ⅱ抗中可加入0.05%的tween-20。PBS洗3次各5min;DAB顯色5-10min，在顯微鏡下掌握染色程度;PBS或自來水沖洗10min;蘇木精復(fù)染2min，鹽酸酒精分化;自來水沖洗10-15min;脫水、透明、封片、鏡檢。

1.2.1.2 結(jié)果判定［4］：TGF- β1 陽性表達是細胞核和細胞質(zhì)均出現(xiàn)棕色顆粒，而Smad陽性表達是細胞質(zhì)出現(xiàn)棕色顆粒;每張切片隨機選擇5個視野，統(tǒng)計著色細胞與未著色細胞的比值(陽性率)。根據(jù)陽性率×染色強度計分的乘積將免疫組化組織細胞陽性等級分為4個等級：陰性：積分＜2分;弱陽性：積分波動于2-3分之間;陽性：積分波動于4-6分之間;強陽性：積分＞6分。

1.2.2 Western blotting

1.2.2.1 試劑：SDS-PAGE試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司，轉(zhuǎn)膜緩沖液、膜染色液、包被液、顯色液購于廈門鷺隆生物技術(shù)有限公司

1.2.2.2 提取蛋白和檢測：取不同組別皮膚組織200mg，利用蛋白酶抑制劑提取總蛋白。100℃金屬浴中變性后，進行SDS電泳(4%濃縮膠，12% 分離膠，120V，50mA，1.5h)，用 PVDF 膜轉(zhuǎn)印.5%脫脂奶粉液的封閉2h后，分別加入抗TGF-β1、Smad和β-actin抗體(1：1000)，4℃孵育過夜，次日加入堿性磷酸酶標記山羊抗兔IgG(1：2000)室溫2h。加入顯色液，計算機掃描圖像，并由生物圖像分析系統(tǒng)Bio-Rad公司，Model Gel Doc 2000，美國).分析處理。

1.2.3 Real-time PCR

1.2.3.1 試劑

1.2.3.2 試劑：dNTP、Pfu酶均購于上海生工生物工程有限公司;PCR產(chǎn)物純化試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒均購自上海生工生物工程公司，基因組DNA提取試劑盒購自Promega公司。

1.2.3.3 提取RNA：三組組織的標本各100mg加入500μL的Trizol試劑(Invtrogene公司)和100μL的氯仿，均勻混合后置于離心機進行14000r/min轉(zhuǎn)速的離心10min，將上層水相置于新的EP管后加入同等體積將 RNA沉淀，干燥后加入10μL用DEPC處理去離子水溶解RNA沉淀，置于-80℃保存。

1.2.3.4 引物設(shè)計：針對國內(nèi)TGF-β1、Smad的基因片段保守區(qū)域，根據(jù)美國基因庫(GenBank)收錄的基因序列，表1的引物由廈門鷺隆生物技術(shù)有限公司合成并標記，擴增Ct值利用lightcycler熒光定量PCR儀配備軟件進行分析。Real-Time PCR操作方法按照試劑盒說明書，使用GAPDH作為內(nèi)部參照，將GAPDH的拷貝數(shù)作為校正基數(shù)，通過ABI7000軟件獲得檢測指標Ct(cycle threshold)值，與同樣本中GAPDH的Ct值相減，即獲得該樣本中相應(yīng)指標的ΔCt值。以對照組ΔCt值作為校正，軟件根據(jù)2-ΔΔCT數(shù)值計算得出檢測指標基因濃度水平。PCR擴增產(chǎn)物測序由廈門鷺隆生物技術(shù)有限公司完成。具體序列見表1。

表1 TGF-β1、Smad及GAPDH引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理：所得所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析，圖像分析所產(chǎn)生數(shù)據(jù)用(±s)進行表示，實驗結(jié)果采用單因素方差分析法進行分析描述，組間兩兩比較采用LSD法進行，用等級相關(guān)(Spearman)分析變量之間的相關(guān)性，以α=0.05作為檢驗水準，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1的蛋白表達：TGF-β1陽性表達表現(xiàn)為細胞核和細胞質(zhì)中均有棕黃色顆粒，正常皮膚、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌中的表達分別為陰性、弱陽性和強陽性，其表達水平、表達強度在三者之間有差異(FPA=165.93，F(xiàn)OD=98.65，P ＜0.01)，觀察B組蛋白表達水平高于觀察A組和對照組(P＜0.05)，觀察A組和對照組之間蛋白表達水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。進行Western blotting檢測后發(fā)現(xiàn)正常皮膚、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌三組TGF-β1的蛋白灰度值的表達水平呈遞增式(FPA=113.25，P ＜0.01)，觀察 B 組蛋白表達水平高于觀察A組和對照組(P＜0.05)，觀察A組和對照組之間蛋白表達水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。具體見圖1，圖2。

圖1 三組TGF-β1蛋白表達情況

2.2 Smad的蛋白表達：Smad陽性表達表現(xiàn)為細胞質(zhì)中均有棕黃色顆粒，正常皮膚、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌中的表達分別為弱陽性、陽性和強陽性，其表達水平、表達強度在三者之間有差異(FPA=99.94.93，F(xiàn)OD=78.49，P＜0.01)，觀察 B 組蛋白表達水平高于觀察A組和對照組(P＜0.05)，觀察A組和對照組之間蛋白表達水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。進行Western blotting檢測后發(fā)現(xiàn)正常皮膚、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌三組Smad的蛋白灰度值的表達水平呈遞增式(FPA=102.89，P＜0.01)，觀察B組蛋白表達水平高于觀察A組和對照組(P＜0.05)，觀察A組和對照組之間蛋白表達水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。具體見圖 3，圖 4。

2.3 Real-Time PCR 結(jié)果：觀察 B 組 TGF-β1、Smad基因表達水平高于觀察A組和對照組(P＜0.05)，觀察A組和對照組之間TGF-β1、Smad基因表達水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，見表2。

圖2 Western blotting檢測結(jié)果

圖3 三組Smad蛋白表達情況

圖4 Western blotting檢測結(jié)果

表2 三組標本之間TGF-β1、Smad基因表達情況

2.4 皮膚瘢痕癌中TGF-β1、Smad表達的相關(guān)性：經(jīng)過 Pearson相關(guān)分析，在皮膚瘢痕癌標本中TGF-β1與mRNA TGF-β1(r=0.727 P ＜0.01)，Smad 與 mRNA Smad(r=0.812 P ＜0.01)的表達均呈正相關(guān)。

3 討論

皮膚受損后愈合要經(jīng)歷炎癥期、肉芽組織形成期和瘢痕形成期，在此修復(fù)過程中TGF-β全程參與。皮膚受損后機體應(yīng)激反應(yīng)趨勢大量血小板脫顆粒在傷處聚集，隨后TGF-β對大量單核細胞、中性粒細胞和成纖維細胞產(chǎn)生趨化作用，隨之大量單核細胞、中性粒細胞和成纖維細胞被趨化至皮膚傷處，TGF-β通過自分泌的細胞因子調(diào)節(jié)方式維持其在有效作用的濃度范圍內(nèi);另一方面，TGF-β還可超化炎性細胞和成纖維細胞，超化炎性細胞在傷口聚集，可促進細胞生長因子的分泌，而超化成纖維細胞，可達到刺激多種基質(zhì)蛋白膠原基因的轉(zhuǎn)錄，兩者均可達到愈合傷口的最終目的［5-7］。

經(jīng)過分子生物學(xué)大量研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1/Smad信號通路能抑制和分化角質(zhì)細胞，角質(zhì)細胞分泌的角質(zhì)細胞生長因子對組織損傷具有明顯的促進修復(fù)和保護作用，TGF-β1/Smad信號通路在一定程度上削弱了角質(zhì)細胞修復(fù)組織的作用，Annes JP［8］等對燒傷小鼠進行觀察，發(fā)現(xiàn)Smad3基因敲除的小鼠體內(nèi)的角質(zhì)細胞分裂更快，燒傷創(chuàng)面感染率下降，傷口愈合恢復(fù)更為迅速，這一結(jié)果提示TGF-β信號通路通過Smad蛋白抑制角質(zhì)細胞的增殖而影響傷口組織愈合。加快傷口創(chuàng)面重上皮化過程，減少基質(zhì)的沉淀和炎性細胞的浸潤，可減少傷口愈合過程中肉芽組織的形成數(shù)量，這是傷口愈合的理想方式。

在多數(shù)人類腫瘤患者中存在TGF-β受體和Smad基因的過度表達的現(xiàn)象，有報道［9］認為TGF-β蛋白的增殖與皮膚癌的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)，TGF-β受體蛋白的表達水平和表達強度是評估皮膚腫瘤程度的一個標志性分子生物因子，本研究結(jié)果顯示，瘢痕癌患者的TGF-β蛋白和基因的表達水平和表達強度均高于正常皮膚組別和病理性瘢痕組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，說明TGF-β受體的蛋白和基因在瘢痕癌標本中的高表達可能與瘢痕癌的發(fā)生相關(guān)，其發(fā)生機制可能與TGF-β1影響組織纖維化進程的特質(zhì)相關(guān)：TGF-β1可誘導(dǎo)細胞外基質(zhì)產(chǎn)生沉淀，其中最為明顯的是刺激成纖維細胞而導(dǎo)致粘連蛋白基質(zhì)的沉積，另一方面TGF-β1可降低蛋白酶的活性，抑制細胞外基質(zhì)的降解過程，導(dǎo)致肉芽組織大量形成而促進病理性瘢痕形成，而后惡化成瘢痕癌［10］。

Smad是TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的標志性蛋白，Smads家族蛋白在將TGF-β信號從細胞表面受體傳導(dǎo)至細胞核的過程中起到關(guān)鍵性作用，TGF-β1對細胞進行刺激后，TGF-β1型受體被磷酸化，與下游的Smad2/Smad3相互識別編碼后被活化，與此同時與Smad4結(jié)合成由異源寡聚體形成的復(fù)合體，繼而發(fā)生核轉(zhuǎn)移，從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核后啟動靶基因，促進靶基因的啟動和轉(zhuǎn)錄。2006年Haiyan等［11］使用蛋白免疫印跡法和RT-PCR法觀察TGF-β1刺激細胞周期以及對其下游Smad蛋白家族因子基因的表達影響，發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩細胞模型的Smad基因表達量高于正常模型細胞組別，提示了TGF-β1促進細胞外基質(zhì)過度表達而導(dǎo)致瘢痕的途徑。本研究結(jié)果顯示，瘢痕癌患者的Smad蛋白和基因的表達水平和表達強度均高于正常皮膚組別和病理性瘢痕組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，說明Smad的蛋白和基因在瘢痕癌標本中的高表達可能與瘢痕癌的發(fā)生相關(guān)。這一結(jié)果與Haiyan等所得結(jié)論一致。在相關(guān)性分析中我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1、Smad的蛋白和基因的表達均升高，且兩者呈正相關(guān)關(guān)系，說明在皮膚瘢痕癌的發(fā)生過程中，TGF-β1、Smad發(fā)揮了協(xié)同作用，再者，由于TGF-β1、Smad是TGF-β1/Smad信號通路的標志性因子，故筆者認為瘢痕癌的發(fā)生過程中，TGF-β1/Smad信號通路具有重要關(guān)系，應(yīng)作為治療的新思路，對燒傷后瘢痕的預(yù)防提出新方法提供靶方向。

［1］Bran GM，Sommer UJ，Goessler UR，et al.TGF-1 antisenseimpacts the SMAD signalling system in fibroblasts from keloidscars［J］.Anticancer Res，2010，30(9)：3459-3463.

［2］張畢，林斌，盧志有.TGF-β1/Smads信號通路與脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成研究進展［J］.中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2013，(3)：277-280.

［3］Renzoni E A ，Abraham DJ，Howat S，et al.Gene expression profiling reveals novel TGF beta targets in adult lung fibroblasts［J］.Respir Res，2004，5：24.

［4］Cai Y，Shen XZ，Zhou CH，et al.Abnormal expression of smurf during the process of rat liver fibrosis［J］.Chin Dig Dis，2010，7(4)：237-245.

［5］楊力.1Smad蛋白家族與 TGF-B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［J］.中國美容醫(yī)學(xué)，2011，10(6)：547-549.

［6］陳琛，葉冬梅，邵淑娟.轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smad信號通路研究進展［J］.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2011，3(2)：126-132.

［7］付晉鳳，譚加.病理性瘢痕的發(fā)生機制與修復(fù)［J］.中華損傷與修復(fù)雜志(電子版)，2013，(4)：347-353.

［8］Annes JP，Munger JS，Rifkin DB.Making sense of latent TGF beta activation［J］.Cell Sci，2009，116(Pt 2)：217-224.

［9］劉暢，陳敏亮.瘢痕疙瘩發(fā)病的分子機制研究進展［J］.中國美容醫(yī)學(xué)，2013，(14)：1557-1560.

［10］Liu Y，Yang D，Xiao Z，et al.miRNA expression profiles in keloid tissue and corresponding normal skin tissue［J］.Anesthetic Plast Surg，2012，36(1)：193-201.