人胰腺癌CD133+/ABCG2+腫瘤細(xì)胞亞群篩選及耐藥性研究*

史堅(jiān)強(qiáng)，陳太平，張國(guó)強(qiáng)，季 昶，曹根寶，吳述良，張 清，崔 磊＊＊，仇海燕

(1.中國(guó)人民解放軍第86醫(yī)院外二科，安徽 馬鞍山 243100 2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

胰腺癌惡性程度極高，確診后生存率很低，是美國(guó)癌癥病死亡原因的第四位或第五位，占胃腸道癌癥死亡的1/5［1］。由于胰腺位于腹膜后，癥狀、體征的不明顯和不典型使之難以得到早期治療，臨床治療效果差［2］，總的5年生存率僅為5%左右。目前，手術(shù)切除癌腫是治療早期胰腺癌唯一有效的根治方法，而放化療等綜合性治療的效果均不滿意。因此，分子水平研究原發(fā)性胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥性機(jī)制，已成為當(dāng)今胰腺癌研究中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究擬利用流式細(xì)胞儀分選(FCM Sorting)技術(shù)從原代胰腺癌組織中分選出CD133+/ABCG2+的細(xì)胞群，并且通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)分析其特異性指標(biāo)，從而確定該群細(xì)胞在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用，為后續(xù)腫瘤化療藥物的篩選提供有效模型。

1 材料與方法

1.1 CD133+/ABCG2+人胰腺癌亞群細(xì)胞的篩選：無菌條件下收集胰腺癌患者手術(shù)中切除的腫瘤組織，用PBS清洗組織2次，剪去除組織中的壞死組織等，將腫瘤組織浸泡于青霉素(1000U/mL)和鏈霉素(1000U/mL)混合液中10min。棄去浸泡液，將腫瘤組織剪成直徑1mm的組織小塊，然后加入5倍體積的胰酶消化液(0.25%胰酶含0.02%EDTA)，于37℃環(huán)境下震蕩消化30min。隨后，加入5倍體積的含10%胎牛血清的細(xì)胞完全培養(yǎng)基加以終止，上下顛倒震蕩使細(xì)胞脫落，過200目篩網(wǎng)，于1500r/min離心5min。收集細(xì)胞沉淀，加入100μL預(yù)冷的PBS緩沖液，隨后加入rabbit anti-human CD133-FITC和rabbit anti-human ABCG2-PE monoclonal antibodies(eBioscience生物科技有限公司)各4μL，并于4℃環(huán)境中避光孵育30min。利用流式細(xì)胞儀(BD FACSAria，BD Bio-science，CA，USA)將CD133+/ABCG2+和CD133-/ABCG2-分選出來，并懸浮于無血清的干細(xì)胞培養(yǎng)基［DMEM/F12，10ng/mLbasic fibroblast growth factor(bFGF)，10 ng/mL epidermal growth factor(EGF)，5μg/mL insulin和0.5%bovine serum albumin(BSA)，上述試劑均購于Sigma-Aldrich試劑公司］中，在37℃、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2 RNA抽提與實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)：按Tr-Izol Reagent說明書的步驟，抽提各組細(xì)胞的Total RNA，并且利用ReverTra Ace M-mLVReverse Transcriptase和寡核苷酸引物Oligo(dT)18經(jīng)RT-PCR生成對(duì)應(yīng)的cDNA。測(cè)定其濃度，-20℃保存。以上述反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA作為模板，在Eppendorf RealPlex4(Eppendorf CO.，LTD)上，利用兩步法進(jìn)行qRT-PCR，根據(jù)相對(duì)定量法(mRNA的相對(duì)變化量Ratio=2-ΔΔCt︱ ΔΔCt=［ΔCt_CD133+/ABCG2+-ΔCt_CD133-/ABCG2-］)計(jì)算目標(biāo)片段的擴(kuò)增比例。擴(kuò)增產(chǎn)物以2%的Agrose Gel電泳進(jìn)行分析。檢測(cè)中設(shè)立空白對(duì)照(blank control)，均以ddH2O作為模板，各樣本設(shè)立3個(gè)重復(fù)，以18SrRNA作為內(nèi)參。

1.3 免疫熒光(IF)鑒定：各組細(xì)胞用 PBS(0.02 moL/L，pH7.4)清洗2次，然后用4%多聚甲醛溶液常溫下固定20min固定液，用封閉液(0.02mol/L PBS中加入0.2%Triton-100和5%正常山羊血清)在37℃下封閉60min。棄封閉液，用PBST(0.02mol/L PBS中加入0.2%Triton-100)漂洗3次，每次5min。棄廢液，加入一抗(rabbit anti-human Oct3/4 antibody;rabbit anti-human Nanog antibody;Santa Cruz公司)，于37℃下孵育45min。反應(yīng)完畢后，用PBST漂洗3次，每次10min，然后加入熒光標(biāo)記二抗(goat anti-rabbit Cy3-conjection antibody;Santa Cruz公司)及DAPI，于37℃下避光孵育45 min。反應(yīng)結(jié)束后，用PBST漂洗3次，用50%丙三醇封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.4 軟瓊脂(Soft Agar)克隆集落形成實(shí)驗(yàn)：在42℃水浴中，將存儲(chǔ)濃度為1.2%的低熔點(diǎn)瓊脂糖與2×細(xì)胞完全培養(yǎng)基以1：1(v/v)混合，形成終濃度0.6%的底層瓊脂，取1.4mL加入6孔板的一個(gè)孔中。待完全凝固后，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，并調(diào)細(xì)胞濃度為2×104/mL。再將存儲(chǔ)濃度為0.6%的低熔點(diǎn)瓊脂糖與2×細(xì)胞完全培養(yǎng)基以1：1(v/v)混合，形成終濃度為0.3%的上層瓊脂，取1.0mL上層瓊脂與0.1mL細(xì)胞懸液充分混勻，加入已有下層瓊脂的6孔板中，待其凝固后，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3周，計(jì)算細(xì)胞克隆集落形成率。

1.5 MTT比色法檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞耐藥性：各組細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(密度為2×103)。在藥物組孔中分別加入30nmoL/μL的順鉑和35nmoL/μL的吉西他濱，而陰性對(duì)照組中分別加入等體積的PBS緩沖液，置于37℃，5%CO2環(huán)境中分別培養(yǎng)24，48，96h。在檢測(cè)前的 4h 加入 MTT 20μL(5mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心去上清且加入DMSO溶解沉淀。用酶標(biāo)儀在490nm處讀取所對(duì)應(yīng)的吸光度值(D490)，設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，取其平均值。測(cè)得各孔吸光度數(shù)值，利用公式：(1-實(shí)驗(yàn)組D值/對(duì)照組D值)×100%，計(jì)算出藥物對(duì)于細(xì)胞的增殖抑制率。

1.6 Western blot檢測(cè)：收集各組細(xì)胞，根據(jù) Western blot Kit說明書中的步驟，抽提各組細(xì)胞的總蛋白，利用Lowry法測(cè)定總蛋白濃度，以每個(gè)泳道20μg濃度的蛋白樣品上樣，經(jīng)30%變性SDS-PAGE電泳后，利用半干電轉(zhuǎn)化法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)過封閉、一抗(稀釋倍數(shù)1：1000)孵育、PBST洗脫、HRP標(biāo)記的二抗(稀釋倍數(shù)1：500)孵育、PBST再洗脫等步驟后，ECL化學(xué)發(fā)光及X光片暴光，并且經(jīng)定影顯影處理，獲得清晰條帶。利用BandScan軟件分析各條帶的A值。

1.7 裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)：收集各組細(xì)胞、離心、收集沉淀，利用冰預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整至細(xì)胞密度為10000/μL。取2只裸鼠(購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，分別于背部皮下組織注射20μL細(xì)胞懸液，其中1只注射CD133+/ABCG2+細(xì)胞，另1只注射CD133-/ABCG2-細(xì)胞。所有裸鼠均飼養(yǎng)于相同的環(huán)境(SPF級(jí))中，每周觀察一次背部瘤體形成情況。

1.8 亞硫酸氫鈉處理及甲基化特異性PCR(MS-PCR)鑒定ABCG2啟動(dòng)子甲基化：抽提各組細(xì)胞的基因組 DNA，并按CpGeno-meTM DNA Modification Kit說明書的步驟完成基因組DNA的體外修飾。取各組細(xì)胞重亞硫酸鹽修飾后的基因組DNA(2μL)作為模板，同時(shí)在PCR管中分別加入上下游引物(0.01nmoL)各0.5μL、2 × HotStart Taq PCR MasterMix 10μL 及ddH2O7μL，使得MS-PCR總反應(yīng)體系為20μL。根據(jù)引物序列及PCR反應(yīng)過程及溫度進(jìn)行MS-PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)完成后，其產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂塘凝膠檢測(cè)，并且利用BandScan軟件分析各條帶的A值。

2 結(jié)果

2.1 CD133+/ABCG2+亞群細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志：本研究中，我們共收集了3例胰腺癌患者的手術(shù)切除腫瘤組織(編號(hào)為：PC1-PC3)，都為胰腺導(dǎo)管腺癌，病理分期為Ⅱ期。通過胰酶消化和流式細(xì)胞分選技術(shù)，我們從胰腺癌組織中獲取了CD133+/ABCG2+的細(xì)胞亞群。經(jīng)過流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌原代細(xì)胞中，CD133+/ABCG2+細(xì)胞亞群所占的比例非常小，而絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞為CD133-/ABCG2-細(xì)胞(占總細(xì)胞數(shù)的)。原代的CD133+/ABCG2+和CD133-/ABCG2-均以無血清培養(yǎng)基在體外進(jìn)行懸浮培養(yǎng)(suspended cultured)，當(dāng)傳代至第9代的時(shí)候，CD133-/ABCG2-出現(xiàn)大量的死亡細(xì)胞，而CD133+/ABCG2+細(xì)胞成團(tuán)生長(zhǎng)，其中細(xì)胞顆粒小且密集，折光度好，顯示出非常好的生長(zhǎng)狀態(tài)(圖1)。我們利用qRT-PCR檢測(cè)了各類細(xì)胞群干細(xì)胞生物標(biāo)志(bio markers)表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CD133+/ABCG2+細(xì)胞群較CD133-/ABCG2-細(xì)胞群高表達(dá)SoX2、Oct4等干細(xì)胞標(biāo)志(圖2)。同時(shí)，Western blot和免疫熒光(IF)檢測(cè)也同樣顯示了CD133+/ABCG2+細(xì)胞群較CD133-/ABCG2-細(xì)胞群高表達(dá)干細(xì)胞生物標(biāo)志(圖3)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CD133+/ABCG2+細(xì)胞群具有典型的干細(xì)胞特性。

2.2 CD133+/ABCG2+亞群細(xì)胞在體外增殖能力明顯增強(qiáng)且具有高侵襲性：選擇第7代的細(xì)胞，每2d統(tǒng)計(jì)一次細(xì)胞的增殖數(shù)量，連續(xù)計(jì)算10d，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，CD133+/ABCG2+細(xì)胞亞群自第4天起出現(xiàn)明顯的增殖趨勢(shì)，而CD133-/ABCG2-亞群細(xì)胞至第6天才進(jìn)入增殖期。結(jié)果表明，CD133+/ABCG2+亞群細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我增殖能力(圖4)。同時(shí)，細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CD133+/ABCG2+亞群細(xì)克隆形成能力明顯高于CD133-/ABCG2-亞群細(xì)胞(圖4)。

圖1 CD133+/ABCG2+的細(xì)胞亞群

圖2 CD133+/ABCG2+細(xì)胞群較CD133-/ABCG2-細(xì)胞群高表達(dá)SoX2、Oct4等干細(xì)胞標(biāo)志

圖3 A：0到10d不同組別胰腺癌亞群細(xì)胞的體外增殖檢測(cè)(MTT);B：不同細(xì)胞亞群軟瓊脂集落形成;C：不同細(xì)胞對(duì)順鉑和吉西他濱耐受性的MTT檢測(cè)

圖4 A：qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果;B：Western blot檢測(cè)結(jié)果。*P＜0.05，＊＊P ＜0.01，#P ＞0.05，n=3。

2.3 CD133+/ABCG2+亞群細(xì)胞具有高耐藥性：MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在順鉑或吉西他濱藥物刺激下，CD133-/ABCG2-細(xì)胞呈現(xiàn)出顯著的增殖抑制現(xiàn)象，其增殖抑制強(qiáng)度與化療藥物刺激時(shí)間的長(zhǎng)短具有明顯的相關(guān)性(圖4)。而CD133+/ABCG2+細(xì)胞對(duì)于順鉑或吉西他濱均表現(xiàn)出很好的耐受性，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，其增殖抑制率均顯著低于CD133-/ABCG2-細(xì)胞。結(jié)果證實(shí)，CD133+/ABCG2+亞群細(xì)胞具有較高腫瘤細(xì)胞化療藥物耐受性。

2.4 CD133+/ABCG2+亞群細(xì)胞具有高致瘤性：選取少量的細(xì)胞(約為10000/μL)接種于裸鼠背部皮下。大約在8周之后，CD133+/ABCG2+細(xì)胞接種鼠的背部可以觀察到有明顯的瘤體產(chǎn)生，而接種CD133-/ABCG2-細(xì)胞的裸鼠背部相同位置上并未發(fā)現(xiàn)有瘤體。繼續(xù)飼養(yǎng)2周，CD133+/ABCG2+細(xì)胞接種鼠的瘤體不斷長(zhǎng)大，而接種CD133-/ABCG2-細(xì)胞的裸鼠背部仍然未發(fā)現(xiàn)有瘤體長(zhǎng)出(圖5)。裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)說明，CD133+/ABCG2+細(xì)胞具有典型的腫瘤干細(xì)胞強(qiáng)致瘤性的特征。

圖5 左：CD133-/ABCG2-細(xì)胞亞群注射組;右：CD133+/ABCG2+細(xì)胞亞群注射組;

2.5 多耐藥基因ABCG2啟動(dòng)子區(qū)域在CD133+/ABCG2+亞群細(xì)胞中呈現(xiàn)去甲基化狀態(tài)：兩組細(xì)胞的基因組DNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理后，以ABCG2啟動(dòng)子區(qū)甲基化和非甲基化特異性引物進(jìn)行MS-PCR檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在CD133+/ABCG2+亞群細(xì)胞中，ABCG2非甲基化引物PCR結(jié)果呈現(xiàn)出陽性條帶，而在CD133-/ABCG2-亞群細(xì)胞中，ABCG2非甲基化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物則無明顯條帶，提示CD133+/ABCG2+細(xì)胞亞群中，ABCG2啟動(dòng)子區(qū)域存在去甲基化現(xiàn)象(圖6)。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CD133+/ABCG2+胰腺癌細(xì)胞中，由于ABCG2啟動(dòng)子去甲基化而導(dǎo)致其高表達(dá)，使其具有較強(qiáng)的化療耐藥性。該研究中，利用5-Aza-CdR(10μmol/L)處理細(xì)胞，作為MS-PCR檢測(cè)的陰性對(duì)照。

圖6 ABCG2基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化修飾檢測(cè)

3 討論

腫瘤學(xué)傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，腫瘤中每個(gè)瘤細(xì)胞都具有無限增殖和形成克隆瘤灶的的能力，但具體哪個(gè)瘤細(xì)胞能夠形成新瘤灶是隨機(jī)的。而現(xiàn)在頗受關(guān)注的“腫瘤干細(xì)胞(Cancer Stem Cell)學(xué)說”則對(duì)此種觀點(diǎn)提出挑戰(zhàn)。該學(xué)說認(rèn)為，腫瘤組織中存在著一小群腫瘤干細(xì)胞(或起始細(xì)胞);其單個(gè)細(xì)胞即可發(fā)展為腫瘤，具有干細(xì)胞自我更新和多向分化能力等特征。此種學(xué)說還認(rèn)為，腫瘤干細(xì)胞是惡性腫瘤形成的起始細(xì)胞，維持著腫瘤的生長(zhǎng)，可能是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥機(jī)制的根源［3，4］。

利用流式細(xì)胞術(shù)來分選出具有特定分子標(biāo)志的細(xì)胞群體是篩選腫瘤干細(xì)胞的經(jīng)典方法。腫瘤學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞來源于一群邊緣細(xì)胞群(Side Population，SP)［5，6］，亦稱之為側(cè)群細(xì)胞。1996年Goodle等利用流式細(xì)胞術(shù)研究骨髓細(xì)胞的細(xì)胞周期時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過Hoechst33342染色后并非所有的細(xì)胞都可發(fā)出藍(lán)色熒光，而有大約不到0.1%的細(xì)胞并未被染料著色。然而，這群細(xì)胞卻高度表達(dá)干細(xì)胞的標(biāo)記sca1+/Lin-［7］。相關(guān)研究同時(shí)還指出，SP細(xì)胞之所以能夠不被Hoechst33342染色，是由于其高度表達(dá)ABCG2蛋白。ABCG2蛋白全稱為ATP結(jié)合G蛋白偶聯(lián)超家族泵蛋白成員，其存在可以將一些小分子染料(Hoechst33342、羅丹明123等)及化療藥物等物質(zhì)通過離子交換形式泵出細(xì)胞外，以避免這些物質(zhì)對(duì)細(xì)胞生理生化活動(dòng)的干擾。由此可見，在腫瘤細(xì)胞中，ABCG2蛋白的表達(dá)情況與腫瘤耐藥性具有密切的聯(lián)系;而腫瘤干細(xì)胞之所以高度耐藥，與其細(xì)胞膜上ABCG2蛋白的過度表達(dá)關(guān)系密切［8］。

本試驗(yàn)中，利用流式細(xì)胞儀分選(FCM Sorting)技術(shù)從原代胰腺癌組織中分選出CD133+/ABCG2+的細(xì)胞群，并且通過細(xì)胞體外增殖實(shí)驗(yàn)、耐藥性實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)、熒光定量PCR及Western Blotting分析其耐藥性、干細(xì)胞標(biāo)志、腫瘤克隆形成率及遷徙特性，結(jié)果表明該亞群細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物(如：Oct4、SoX2)，和普通胰腺癌細(xì)胞相比，具有更強(qiáng)的侵襲性和克隆形成能力以及更強(qiáng)的化療耐藥性。另外裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)表明該亞群細(xì)胞具有更強(qiáng)的體內(nèi)成瘤能力。隨后，通過DNA甲基化檢測(cè)證實(shí)，多耐藥(multi-drug resistant)基因ABCG2啟動(dòng)子差異性甲基化是導(dǎo)致該細(xì)胞呈現(xiàn)出化療藥物耐受性的重要原因。

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