補(bǔ)體C5a對(duì)低氧腦損傷大鼠分泌IL-6的調(diào)節(jié)作用研究

周亞妮，李 可

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西西安710061;2.商洛職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 商洛726000)

缺氧是大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損的重要因素，腦組織對(duì)氧氣較為敏感[1]。適量低氧，機(jī)體可呈現(xiàn)生理性適應(yīng)，而重度、中度低氧則會(huì)使機(jī)體發(fā)生病理性變化，導(dǎo)致炎癥因子異常表達(dá)，異常表達(dá)的一些細(xì)胞因子可發(fā)生相互影響和調(diào)節(jié)。炎癥是腦缺氧病理生理過程中的重要環(huán)節(jié)，在缺氧缺血性腦損傷中發(fā)揮重要作用[2]。目前多集中于大鼠在不同濃度的低氧及處理時(shí)間下所引發(fā)的腦損傷及分泌炎癥遞質(zhì)IL－6的研究。而在大鼠缺氧腦損傷中，涉及分子免疫學(xué)方面的補(bǔ)體趨化因子C5a與炎癥遞質(zhì)IL－6的相關(guān)研究較少。鑒于此，在諸多研究基礎(chǔ)上，本研究觀察了大鼠在重度(1%)、中度(4%)低氧環(huán)境下處理3 h后引發(fā)的炎癥大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的補(bǔ)體C5a對(duì)于IL－6分泌的調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SD大鼠54只，體質(zhì)量(270±20)g，分為1%低氧建模組(A組)18只、4%低氧建模組(B組)18只和常氧量對(duì)照組(C組)18只。動(dòng)物均購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 大鼠C5a ELISA抗體，2%B－27添加劑，Neurobasal培養(yǎng)基，1%青霉素－鏈霉素溶液，D－Hands液，磷酸鹽酸緩沖液，PCR Master Mix，其他常用化學(xué)試劑。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材 ELISA檢測(cè)試劑盒，細(xì)胞培養(yǎng)箱，光學(xué)倒置顯微鏡，低氧工作站，96孔板。

1.4 方法

1.4.1 不同環(huán)境下分離、培養(yǎng)、收集雄性SD大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞 將54只大鼠分為 3組，每組18只。A組:在1%氧濃度的低氧工作站中放置3 h;B組:在4%氧濃度的低氧工作站中放置3 h;C組:常氧量(20%)狀態(tài)下正常放置。不同氧濃度處理后，麻醉并固定于手術(shù)臺(tái)上，無菌情況下分離出雙側(cè)大腦皮質(zhì)，經(jīng)剪碎、消化、過濾、離心后接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，按時(shí)換液，每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，后即刻收集大腦皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液，另外，需要收集上清液用于小鼠C5a蛋白水平檢測(cè)。

1.4.2 低氧環(huán)境下大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞收集液中補(bǔ)體C5a的檢測(cè) C5a、IL－6檢測(cè)嚴(yán)格依據(jù)細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒說明操作。一抗(1～5 mg/L)溶解于包被液(碳酸鹽緩沖液pH 9.6)，每孔100 μL包被ELISA親和96孔板，4℃放置過夜后，10%FCS/PBS封閉1 h。PBS－T洗板3次，每孔加入100 μL樣品，室溫1 h，PBS－T洗板3次，加入Biotin化抗體(1～5 mg/L)，室溫放置1 h，PBST 洗5次，加入 Avidin－HRP(1∶1000稀釋，100 μL/孔)室溫放置30 min，以 TMB 顯色系統(tǒng)顯色，測(cè)OD492或OD450值，分析補(bǔ)體C5a在大鼠低氧腦損傷中對(duì)IL－6分泌的影響。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞收集液補(bǔ)體C5a及IL－6水平比較 A組、B組較C組C5a明顯升高，IL－6降低。見表1。

表1 各組大鼠大腦細(xì)胞產(chǎn)生C5a及分泌IL－6情況比較(±s，ng/L)

表1 各組大鼠大腦細(xì)胞產(chǎn)生C5a及分泌IL－6情況比較(±s，ng/L)

注:①與 C 組比較，P ＜0.05。

項(xiàng)目 C組 B組 A組C5a 1.61 ±0.533.29 ±0.98① 12.35 ±2.68①IL －6332.49 ±15.64313.51 ±10.96① 155.57 ±1.83①

2.2 給予抗C5a單克隆抗體及外源性C5a后IL－6水平比較 給予等量抗C5a單克隆抗體后，C組、B組、A組IL－6水平分別為(294.15 ±12.03)ng/L、(225.87 ±11.61)ng/L、(69.58 ±3.67)ng/L，A組IL－6水平明顯低于C組和B組(P均＜0.01)。給予外源性 C5a后，C組、B組、A組 IL－6水平分別為(336.41 ±14.12)ng/L、(337.35 ± 13.96)ng/L、(388.03 ±16.11)ng/L，A組水平明顯高于B組和C組(P均＜0.01)。

3 討論

IL－6是重要的細(xì)胞因子，而C5a是重要的炎癥遞質(zhì)，在大鼠不同程度腦缺氧損傷中，有一定的消長(zhǎng)關(guān)系，并參與免疫調(diào)節(jié)。Loddick等[3]研究表示，IL－6可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化，在缺血性腦損傷中發(fā)揮著神經(jīng)保護(hù)作用。但Gorina等[4]研究顯示，IL－6對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有傷害性，可加重腦組織損傷。Wang等[5]以大鼠為模型，研究證實(shí)信號(hào)通路介導(dǎo)了缺血性低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化的過程。

本研究結(jié)果表明，無論1%還是4%氧濃度環(huán)境處理大腦皮質(zhì)細(xì)胞3 h后，對(duì)細(xì)胞表達(dá)IL－6均有誘導(dǎo)的趨勢(shì)，這說明中低濃度缺氧對(duì)大腦皮質(zhì)細(xì)胞表達(dá)IL－6起阻滯作用。李華華等[6]研究證實(shí)低氧對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞表達(dá) IL－6具有時(shí)間依賴性。Liu等[7]發(fā)現(xiàn)低氧可誘導(dǎo)頸動(dòng)脈體表達(dá) IL－6 mRNA，而隨著時(shí)間延長(zhǎng)，誘導(dǎo)作用更加明顯。這提示無論缺血性低氧、缺血再灌注還是單純一次性低氧都可誘導(dǎo)IL－6 mRNA 表達(dá)。Li等[8]發(fā)現(xiàn)間歇性低氧(5%，7.5%和 10%)和持續(xù)性低氧(10%)均可使大鼠血清中IL－6升高，提示低氧可促進(jìn)IL－6蛋白表達(dá)。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。

本研究還顯示，給予C5a拮抗劑后，隨著氧濃度的降低，IL－6的表達(dá)也降低，這說明C5a在小鼠缺氧腦損傷過程中參與了L－6表達(dá)的調(diào)節(jié)，且發(fā)揮著負(fù)性調(diào)控作用[9]。

本研究進(jìn)一步明確IL－6在大鼠低氧腦損傷中的表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制，并證明小鼠在低氧環(huán)境中大腦皮質(zhì)細(xì)胞分泌的IL－6在一定程度上受C5a調(diào)控，在病理狀態(tài)如低氧腦損傷過程中，異常表達(dá)則出現(xiàn)中性粒細(xì)胞趨化致其炎癥反應(yīng)的發(fā)生，那么C5a將得到活化，活化的C5a又可吸引具有C5a受體的小吞噬細(xì)胞之中的中性粒細(xì)胞游走到補(bǔ)體被趨化的部位[10]?？梢酝茢啵@個(gè)環(huán)節(jié)將有可能呈現(xiàn)惡性循環(huán)，繼而加重腦組織損傷。也許在特定的調(diào)節(jié)環(huán)境中，其他的免疫因子或者細(xì)胞也參與并發(fā)揮作用，這有待于進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)其探索和研究。目前關(guān)于低氧對(duì)炎癥因子表達(dá)機(jī)制涉及了很多因素，如能將這些因素的歸結(jié)點(diǎn)折射在某一點(diǎn)面上，那么對(duì)于探索缺氧性的腦損傷與炎癥因子以及免疫分子之間的關(guān)聯(lián)是一個(gè)新的途徑，在臨床缺氧性腦損傷治療中，也是一個(gè)新的治療思路，同時(shí)為尋求特異性的干預(yù)策略提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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