長期限食對大鼠頸內(nèi)動脈嘌呤受體反應性調(diào)節(jié)的影響

武 懿，李曉麗，武廣義，李 璐

(1.河北大學附屬醫(yī)院，河北保定073200;2.冀中能源峰峰集團總醫(yī)院，河北邯鄲056200)

隨著人們生活水平的提高，糖尿病、高血壓、高血脂和心臟病的發(fā)病率也隨之增高。為了改善生活質(zhì)量，有關限制飲食減少老齡化相關疾病的發(fā)生發(fā)展以及在退行性疾病中的作用機制受到日益關注。研究發(fā)現(xiàn)限制飲食可顯著降低穩(wěn)態(tài)胰島素抵抗指數(shù)，升高胰島素敏感性以及胰島β細胞的分泌功能，使血漿游離脂肪酸以及總膽固醇含量降低，從而間接改變動脈粥樣硬化的進展[1]。Heilbronn等[2]發(fā)現(xiàn)限食對高密度脂蛋白膽固醇和三酰甘油的影響具有性別差異，隔日限食3周可升高女性受試者血液高密度脂蛋白膽固醇，降低男性受試者三酰甘油水平。Fontana等[3]研究指出限食6 a可顯著降低受試者血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、三酰甘油、超敏C反應蛋白、血小板衍化生長因子AB等冠狀動脈粥樣硬化危險因子，并使受試者的收縮壓及舒張壓顯著下降，升高高密度脂蛋白水平;而且長期限食使頸動脈內(nèi)膜中層厚度減少約40%，成為降低動脈粥樣硬化風險的有力證據(jù)。動物實驗證實，限食可顯著降低SD大鼠心肌缺血區(qū)域心肌細胞凋亡率以及心肌梗死面積，并抑制受累心肌區(qū)域的炎性反應[4]。在限食對血管功能影響方面，發(fā)現(xiàn)母體孕期限食可降低胎兒出生后小腸系膜動脈內(nèi)皮依賴性舒張反應[5]。同時，筆者研究發(fā)現(xiàn)長期限食不影響大鼠去內(nèi)皮尾動脈平滑肌的肌性收縮反應，但顯著增強P2X1受體和α1受體介導的血管收縮反應[6]。本研究擬觀察長期限食對大鼠頸內(nèi)動脈不同受體介導收縮反應的影響，以評估腦組織的供應血管頸內(nèi)動脈與外周血管尾動脈的收縮反應在長期限食后可能存在的差異。

1 實驗資料

1.1 儀器、藥品及藥液配制 去甲腎上腺素(NA)、乙酰膽堿(ACh)、α，β －亞甲基 ATP(α，β －MeATP)、脫氧皮質(zhì)酮、吲哚美辛、普萘洛爾和地昔帕明均由Sigma公司提供。ERT884四道生理記錄儀和張力換能器由河南開封友林電子有限公司提供。精確稱取一定量藥物，加入雙蒸水定容，配制成一定濃度的母液，母液貯存于棕色瓶中，置－20℃冰箱內(nèi)備用。臨用前取一定量的溶液，以雙蒸水按倍比稀釋成所需濃度的溶液。脫氧皮質(zhì)酮溶于丙二醇;吲哚美辛由乙醇稀釋到所需濃度。

1.2 實驗動物和分組 雄性Wistar大鼠，周齡12～13周，體質(zhì)量300～350 g。大鼠購入后，適應性飼養(yǎng)3 d。隨機分為 2組:限食組(FRG)18只，大鼠每天18:00給予日飲食量的50%[6]，自由飲水。對照組(CG)18只，大鼠自由飲食。

1.3 大鼠離體頸內(nèi)動脈環(huán)的制備 大鼠分組飼養(yǎng)3周后，25%烏拉坦1.5 g/kg皮下注射進行麻醉，經(jīng)股動脈放血處死后，頸部正中切開皮膚，暴露頸總動脈，剪取左右頸內(nèi)動脈，即頸總動脈分叉至顱骨段，迅速置于4℃改良K－H液(Krebs－Henseleit solution)。仔細剔除血管周圍的結(jié)締組織，并用表面粗糙的銅絲去除血管內(nèi)皮，截取3～4 mm寬的血管環(huán)置于(37±0.5)℃ K－H液中，持續(xù)通以95%O2和5%CO2的混合氣體，對血管環(huán)施以1 g靜息張力[7]，用ERT－884四道生理記錄儀記錄血管的張力信號。在平衡期間，每15 min更換1次恒溫的K－H液以供應動脈所需的養(yǎng)分。平衡1 h后，用去甲腎上腺素(NA)3×10－7mol/L預收縮血管，用乙酰膽堿10－6mol/L檢驗血管內(nèi)皮的完整性。

1.4 實驗設計 將 2組中不產(chǎn)生任何舒張反應的標本進行進一步實驗。首先建立NA(10－9～10－4mol/L)的收縮反應曲線以觀察血管的收縮反應性，剔除在血管標本制備過程中對血管產(chǎn)生損傷的標本;其次，每組進一步分成NA組和α，β－MeATP組，檢測NA累積給藥和α，β－MeATP單濃度給藥誘發(fā)血管的收縮反應;最后，所有標本于實驗結(jié)束前累積給予KCl(10～120 mmol/L)，記錄KCl誘發(fā)的收縮反應。并于實驗結(jié)束后去除標本多余水分稱量標本濕質(zhì)量。

1.5 統(tǒng)計學處理 NA、α，β－MeATP和KCl誘發(fā)的血管收縮反應以標本張力(g)/標本濕質(zhì)量(mg)的均數(shù)±標準差表示。利用統(tǒng)計軟件計算3種血管激動劑誘發(fā)收縮反應的EC50值。組間比較采用雙因素方差分析(two－way ANOVA)比較2條濃度－反應量效曲線，兩對應濃度間的藥物效應比較采用Bonferroni檢驗。標本濕質(zhì)量、KCl最大收縮反應以及3種激動劑收縮反應的EC50值比較采用非配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。用Graph Pad Prism軟件進行統(tǒng)計學分析及圖形處理。

2 結(jié)果

2.1 2組對大鼠頸內(nèi)動脈標本濕質(zhì)量比較 對照組與限食組頸內(nèi)動脈的標本濕質(zhì)量分別為(0.65±0.11)mg和(0.61±0.11)mg，2組比較無顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 2組頸內(nèi)動脈標本的收縮反應性比較 在 2組中，首次累積給予NA后，NA誘發(fā)的血管收縮反應均呈濃度依賴性。雙因素方差分析結(jié)果顯示，2組頸內(nèi)動脈標本的血管收縮反應性均無顯著性差異(P＞0.05)。見圖1 和圖2 。

圖1 對照組大鼠頸內(nèi)動脈血管收縮反應性

圖2 限食組大鼠頸內(nèi)動脈血管收縮反應性

2.3 2組NA誘發(fā)大鼠頸內(nèi)動脈收縮反應的比較 與對照組比較，長期限食后NA誘發(fā)大鼠頸內(nèi)動脈血管收縮反應增大(P＜0.01)，見圖3 ;10－4mol/L NA誘發(fā)的收縮反應增大了19.42%。NA誘發(fā)收縮反應的－log EC50值在對照組和限食組分別為(7.40 ±0.24)mol/L 和(7.23 ±0.10)mol/L，2組比較無統(tǒng)計學差異(t=1.9840，P=0.0647)。

圖3 NA誘發(fā) 2組大鼠頸內(nèi)動脈血管收縮反應

2.4 2組α，β－MeATP誘發(fā)頸內(nèi)動脈收縮反應的比較 與對照組比較，長期限食明顯增大了α，β－MeATP誘發(fā)的收縮反應(P＜0.01)，見圖 4;10－4mol/L α，β －MeATP 誘發(fā)的收縮反應增大了21.76%。α，β－MeATP誘發(fā)收縮反應的－log EC50值在對照組和限食組分別為(5.18±0.11)mol/L和(5.14±0.19)mol/L，與對照組比較，限食 3周對 α，β －MeATP 的 －log EC50值無明顯影響(t=0.3210，P=0.7565)。10－4mol/L α，β－MeATP誘發(fā)頸內(nèi)動脈收縮反應與同濃度NA誘發(fā)收縮反應的比值在對照組和限食組分別為43.02%和 43.76%。

圖4 α，β－Me ATP誘發(fā) 2組大鼠頸內(nèi)動脈血管收縮反應

2.5 2組KCl誘發(fā)頸內(nèi)動脈收縮反應的比較 大劑量KCl(120 mmol/L)可對血管收縮產(chǎn)生損傷作用，使血管收縮值降低。與對照組比較，長期限食明顯增大了KCl誘發(fā)的收縮反應(P＜0.01)，見圖5 ;KCl誘發(fā)頸內(nèi)動脈收縮反應的最大反應增加了36.63%。KCl在大鼠頸內(nèi)動脈誘發(fā)收縮反應的EC50值對照組和限食組分別為(22.88±3.72)mmol/L和(22.52±2.39)mmol/L，2組比較無統(tǒng)計學差異(t=0.2338，P=0.8185)。

圖5 KCl誘發(fā) 2組大鼠頸內(nèi)動脈血管收縮反應

3 討論

不同程度的限食可使血三酰甘油、總膽固醇水平降低，同時長期低熱量飲食可使丙二醛水平明顯減低，并抑制體內(nèi)組蛋白去乙酰化酶，從而減輕氧化應激反應，使細胞免于老化并提高抗氧化能力[8]，降低動脈粥樣硬化的風險，延緩年齡相關性心臟自主功能的下降。對血管舒縮功能的研究中，筆者也曾發(fā)現(xiàn)長期限食可增強大鼠尾動脈嘌呤受體和腎上腺素受體介導的血管收縮功能。為評估長期限食對不同部位血管是否產(chǎn)生類似的影響，本研究采用相同的方法研究了長期限食后大鼠頸內(nèi)動脈不同受體介導的血管收縮反應，以觀察限食對重要臟器－腦組織供血動脈的影響。本實驗發(fā)現(xiàn)長期限食可增強大鼠頸內(nèi)動脈P2X1受體與α1受體介導的血管收縮反應，這與筆者系列研究報道的長期限食可使大鼠尾動脈P2X1受體與α1受體介導的收縮反應增強一致[6]，同時也發(fā)現(xiàn)α，β－MeATP和NA在頸內(nèi)動脈誘發(fā)最大收縮反應的比值未受到長期限食的影響，與文獻[6－7]報道的結(jié)果一致，提示長期限食可增強大鼠不同部位血管神經(jīng)源性收縮，從而增強P2X1受體與α1受體介導的血管收縮功能。

除限食增加P2X1受體與α1受體介導的血管收縮反應外，本研究還發(fā)現(xiàn)長期限食增加了大鼠頸內(nèi)動脈KCl誘發(fā)的收縮反應，但對KCl誘發(fā)收縮反應的EC50值無影響，這與既往報道的限食對大鼠尾動脈KCl誘發(fā)最大收縮反應的影響略有不同[6]。Li等[9]報道力竭游泳運動對大鼠頸內(nèi)動脈與尾動脈等外周動脈具有選擇性抑制作用。提示在非生理情況下，大鼠頸內(nèi)動脈與尾動脈的血管收縮反應可出現(xiàn)不同的變化。目前研究認為不同部位血管的縮血管纖維分布密度不同，在皮膚血管縮血管纖維分布最密，而在腦血管分布最少。頸內(nèi)動脈作為腦組織的主要供應血管之一，在組織結(jié)構上必然與尾動脈存在差異，但尚不能對研究結(jié)果給予合理的解釋，有待于進一步的研究。

綜上所述，長期限食可增強大鼠頸內(nèi)動脈血管神經(jīng)源性收縮，從而增強P2X1受體與α1受體介導的血管收縮功能，同時增強其肌性收縮作用，但對縮血管受體結(jié)合率無明顯影響。

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