脊髓損傷后肌肉萎縮lncRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的篩選及驗(yàn)證

劉付春，李筱璐，劉青青，桂裕昌，張寅煒，許建文

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西 南寧 530001；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，廣西 南寧 530000）

SCI是指脊髓受到直接或間接暴力，引起損傷平面及以下的神經(jīng)支配區(qū)域出現(xiàn)運(yùn)動、感覺功能障礙的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。甚至對患者生命造成巨大的威脅，目前尚缺乏有效的治療手段。據(jù)一項(xiàng)Meta 分析顯示，每100 萬人中就約有22.55 萬人發(fā)生SCI，男性的發(fā)病率遠(yuǎn)高于女性，其中又以青壯年人群為主，導(dǎo)致患者勞動力喪失，不僅給患者家庭帶來巨額的治療費(fèi)用及嚴(yán)重的生理負(fù)擔(dān)，也對社會造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1，2］。SCI 后骨骼肌由于失去神經(jīng)支配、營養(yǎng)，肌肉長時間失用，導(dǎo)致肌肉萎縮，對患者的康復(fù)及生活質(zhì)量造成巨大的影響。雖然有證據(jù)表明，電刺激［3，4］、運(yùn)動訓(xùn)練［5，6］等手段具有一定的治療作用，但是效果仍不盡人意，且SCI 后肌肉萎縮的發(fā)生機(jī)制尚未清楚，是SCI 患者康復(fù)待解決的一大難題。近年來，生物信息學(xué)被廣泛運(yùn)用于挖掘高通量測序數(shù)據(jù)的有價值基因，可為研究者提供一定的理論依據(jù)及研究方向，據(jù)此有目的性、針對性地去挑選有研究價值的基因，有望節(jié)約大量的科研時間及精力［7，8］。GSE21497是一個研究SCI后第5 天對比第2 天病人骨骼肌基因表達(dá)譜的數(shù)據(jù)集，在本研究中，從GEO 數(shù)據(jù)庫下載了該數(shù)據(jù)集，對數(shù)據(jù)集里的lncRNAs和mRNAs進(jìn)行了差異表達(dá)分析，構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并對網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，旨在為SCI 后肌肉萎縮的診斷及治療提供一定的理論依據(jù)及靶點(diǎn)選擇。

1 材料與方法

1.1 基因芯片

GSE21497 來源于GEO （gene expression omnibus，https：// www.ncbi.nlm.nih.gov/ geo/）數(shù)據(jù)庫，其基因測序平臺為GPL570［HG-U133_Plus_2］Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，該數(shù)據(jù)庫采用自身對照的方法分別在患者發(fā)生SCI 后的第2 天和第5 天取樣，共收集了10 例（9 男1 女，平均年齡44 歲，其中6 例為四肢癱瘓、4 例為截癱）SCI患者的股外側(cè)肌肌肉活檢樣本。

1.2 數(shù)據(jù)處理及差異表達(dá)基因篩選

利用R 軟件（R.4.2.0）對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，通過exprs 函數(shù)獲取表達(dá)矩陣，使用Affy 包對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制、背景校正及標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理。根據(jù)平臺的注釋信息，對探針進(jìn)行基因標(biāo)記注釋。對雜交到相同探針上的基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，剔除多余的探針。使用Limma 包對差異表達(dá)mRNAs（differentially expressed mRNAs，DEmRNAs）和差異表達(dá)lncRNAs（DElncRNAs）進(jìn)行篩選，篩選條件為P＜0.05 且|logFC|＞0.585。最后，使用pheatmap 包繪制 DEmRNAs 和DElncRNAs 的火山圖及熱圖。

1.3 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

對DEmRNAs 進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted correlation network analysis，WGCNA），分析每對基因之間的Pearson 相關(guān)性，生成關(guān)系矩陣；根據(jù)無標(biāo)度拓?fù)鋽M合指數(shù)（R2）值和平均連接度，確定最佳軟閾值（β），由此構(gòu)建WGCNA。然后，使用以下方法確定與疾病進(jìn)展相關(guān)的關(guān)鍵模塊。首先，根據(jù)基因間的高拓?fù)渲丿B度將相似基因合并，構(gòu)建多個基因模塊，并根據(jù)模塊間的協(xié)同表達(dá)情況對基因模塊進(jìn)行聚類，合并相似度較高的模塊；然后對每個模塊的特征向量基因與疾病進(jìn)展進(jìn)行相關(guān)性分析（每個模塊中基因表達(dá)與疾病進(jìn)展之間相關(guān)性的絕對平均值被視為模塊與疾病進(jìn)展之間的相關(guān)性）。

1.4 lncRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

首先，使用miRcode 數(shù)據(jù)庫預(yù)測與DElncRNAs相互作用的miRNAs，以獲得lncRNA-miRNA 相互作用關(guān)系；然后，使用miRWalk、Targetscan 和miRDB 數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA 的靶基因（binding 概率：0.95；結(jié)合位點(diǎn)位置：3'-UTR）。然后，將預(yù)測的mRNA 與關(guān)鍵共表達(dá)模塊內(nèi)的基因匹配得到關(guān)鍵mRNA，確定miRNA-mRNA 相互作用關(guān)系。最后，使用Cytoscape 3.8 軟件構(gòu)建lncRNA -miRNA -mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并將結(jié)果作圖展示。

1.5 功能富集分析

基于上述分析，確定關(guān)鍵mRNA 后，將關(guān)鍵mRNA 作為功能和通路富集分析的候選基因。利用 DAVID 在線數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行 GO （gene ontology）和KEGG （kyoto encyclopedia of genes and genomes）信號通路富集分析。GO 從生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3 個方面注釋差異基因的功能。

1.6 關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.6.1 關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)篩選 從1.4 構(gòu)建的lncRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，通過查閱文獻(xiàn)進(jìn)一步篩選，挑選關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1.6.2 實(shí)驗(yàn)動物 健康SPF 級成年SD 大鼠8 只，雌性，體重（200±20）g，均購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心［生產(chǎn)許可：SYXK（桂）2020-0004］，飼養(yǎng)于25 ℃，光/暗：12/12 h。

1.6.3 動物模型制備 采用隨機(jī)數(shù)字法進(jìn)行分組，觀察組4 只，對照組4 只。使用戊巴比妥鈉（濃度：3%，30 mg/kg）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動物麻醉，采用經(jīng)典Allen's 打擊法進(jìn)行SCI 模型制備（打擊棒：10 g，打擊棒直徑：2.5 mm，打擊高度：5 cm），術(shù)后連續(xù)3 天給予腹腔注射青霉素以預(yù)防感染，并每天手動按摩大鼠腹部，輔助其排尿、排便。對照組僅暴露脊髓，不進(jìn)行打擊。該實(shí)驗(yàn)方案已得到廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.6.4 取材及RNA 提取 造模后7 d，給予過量麻藥至使老鼠安樂死，后立即采取生理鹽水進(jìn)行心臟灌注，并在冰上對大鼠的股二頭肌進(jìn)行取材。取材完成后使用PBS 緩沖液沖洗3 遍，用濾紙吸取殘留在表面的液體后置于干凈的研磨管中，并使用無菌剪刀盡量把肌肉組織剪碎，加入研磨磁珠、Nucleo-Zol RNA 試劑（macherey-nagel，germany）進(jìn)行充分研磨，然后按照NucleoZol RNA 試劑說明書完成總RNA 提取。

1.6.5 實(shí)時熒光定量PCR 檢測 把總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA（Takara，RR047A 和RR036A，Japan），然后使用7500 熒光定量PCR 儀進(jìn)行cDNA 擴(kuò)增，其中miRNA 使用的內(nèi)參基因?yàn)閁6，mRNA 則為GAPDH，使用的基因引物序列見表1，熒光定量試劑盒為TB Green Premix Ex Taq II（RR820A，Japan），cDNA 相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計算。

表1 AgNPs 的制備途徑Tab 1 Preparation route of AgNPs and their advantages and disadvantages

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究將利用SPSS Statistics 17 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計方法為獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，當(dāng)t＜0.05 時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因

經(jīng)P＜0.05 且|logFC|＞0.585 篩選后，共得到SCI 后第5 天的差異表達(dá)基因1 405 個，其中l(wèi)ncRNA 262 個、mRNA 1 143 個，篩選結(jié)果以火山圖、熱圖展示，詳見圖1A-D。

圖1 SCI 肌肉萎縮的差異表達(dá)基因火山圖和熱圖Fig 1 Volcano plot，and heat map of differentially expressed genes of SCI muscle atrophy

2.2 WGCNA

利用WGCNA 對DEmRNA 進(jìn)行分析，首先對軟閾值（β）進(jìn)行篩選，當(dāng)β 為7 時具有較好的連接關(guān)系（圖2）。然后對基因進(jìn)行模塊化分析，構(gòu)建WGCNA 網(wǎng)絡(luò)分層聚類樹和共表達(dá)模塊，最終得到4 個主要基因模塊（turquoise、blue、brown、grey），其中turquoise 模塊-特征性相關(guān)系數(shù)評分最高達(dá)0.89（圖3）。

圖2 無尺度網(wǎng)絡(luò)軟閾值（β）的篩選Fig 2 Screening of a soft threshold （β）of a scale-free network

圖3 WGCNA 網(wǎng)絡(luò)分層聚類樹和共表達(dá)模塊Fig 3 Hierarchical clustering tree and co-expression module of the WGCNA network

2.3 lncRNA-miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

根據(jù)miRcode 數(shù)據(jù)庫預(yù)測的miRNA 共211 個，通過miRWalk 、Targetscan 和miRDB 數(shù)據(jù)庫預(yù)測的mRNA 共4 922 個，然后把預(yù)測出來的mRNA 與turquoise 模塊里的基因取交集，共得到30 個關(guān)鍵mRNA（圖4），再根據(jù)lncRNA-miRNA 相互作用對和 miRNA-mRNA 相 互 作 用 對 構(gòu) 建lncRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，最后的結(jié)果通過Cytoscape 3.8 進(jìn)行可視化（圖5），并通過查閱文獻(xiàn) ，最 終 選 擇 4 條（LINC00410/miR-17-5p/KCNK10、LINC00410/miR-17-5p/PCDHA3、LIN C00410/miR-20b-5p/KCNK10、LINC00410/miR -20b-5p/PCDHA3）調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（驗(yàn)證了miR-17-5p、3miR-20b-5p、KCNK10、PCDHA 4個基因）。

圖4 關(guān)鍵mRNAFig 4 Key mRNA

圖5 lncRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig 5 lncRNA-miRNA-mRNA regulatory network

2.4 功能富集分析

把2.3 里得到的30 個交集mRNA 利用DAVID在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO、KEGG 信號通路富集分析，分別取BP、CC、MF 排名前10 的結(jié)果及KEGG 通路富集結(jié)果繪圖展示（圖6）。

圖6 GO、KEGG 富集分析Fig 6 GO and KEGG enrichment analyses

2.5 RT-qPCR 檢測結(jié)果

相對于對照組，觀察組模鼠股二頭肌肌肉組織的miR-17-5p（t=0.002 038）、miR-20b-5p（t= 0.000 535）表達(dá)量升高，而KCNK10 mRNA（t=2.074 3E-7）、PCDHA3 mRNA（t=2.137 8E-8）的表達(dá)量降低（圖7）。

圖7 關(guān)鍵基因RT-qPCR 結(jié)果Fig 7 RT-qPCR results of key genes

3 討論

SCI 作為一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重危害著患者的生命，且SCI 后并發(fā)的一系列癥狀也嚴(yán)重影響著患者的生存質(zhì)量，而目前尚未找到有效的治療手段。SCI 后由于神經(jīng)損傷，不能支配和營養(yǎng)肌肉，導(dǎo)致肌肉萎縮，肌肉萎縮又進(jìn)一步加重運(yùn)動功能的損害，導(dǎo)致該區(qū)域的神經(jīng)、肌肉不能得到及時有效的營養(yǎng)，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致肌肉萎縮進(jìn)一步加重。因此探討SCI 后肌肉萎縮的病理機(jī)制及治療手段具有重大的研究意義。嚴(yán)重的SCI 會導(dǎo)致神經(jīng)信號傳導(dǎo)途徑受損、運(yùn)動神經(jīng)元萎縮、神經(jīng)肌肉接頭的病理變化，從而引起肌纖維生成能力減弱，肌肉萎縮、運(yùn)動功能障礙［9，10］。對比大多數(shù)的廢用性肌肉萎縮，SCI 后肌肉萎縮的信號及模式可能更加嚴(yán)重，肌肉萎縮的速度也更快。雖然萎縮信號在嚴(yán)重SCI 后導(dǎo)致肌纖維丟失，但合成代謝信號的減少可能是導(dǎo)致肌肉持續(xù)缺失的原因之一［11］。IGF-1/PI3K/Akt 信號通路的下游蛋白雷帕霉素（mTOR）是參與合成代謝的關(guān)鍵蛋白，mTOR 發(fā)生磷酸化，就會靶向啟動其下游參與翻譯的蛋白，從而增加蛋白質(zhì)的合成，如果該途徑能持續(xù)激活，就有可能逆轉(zhuǎn)肌肉萎縮［12］。研究證明，SCI 后肌纖維含量減少，磷酸化的PI3K、AKT、mTOR 表達(dá)含量下降，這可能是SCI 患者持續(xù)長時間蛋白質(zhì)合成減少、肌肉萎縮的原因之一［13-15］。有報道顯示，SCI 創(chuàng)傷或隨后的手術(shù)干預(yù)會導(dǎo)致患者產(chǎn)生較為劇烈的炎癥反應(yīng)，加劇肌肉萎縮，而使用大劑量的糖皮質(zhì)激素在急性、亞急性期能夠抑制SCI 后繼發(fā)性損傷的炎癥反應(yīng)［16，17］。相反的，亦有研究顯示，大劑量的甲基強(qiáng)的松龍增加了FOXO1、MAFbx、MuRF1 和Redd1 的表達(dá)，而這些蛋白的表達(dá)將會抑制mTOR 的磷酸化，減少蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致肌纖維丟失［18］。雖然目前對SCI 后肌肉萎縮已有不少相關(guān)研究報道，但相關(guān)肌肉萎縮和合成代謝信號模式仍未明確，也缺乏有效的治療手段。本研究從分子機(jī)制水平上探討了SCI 后肌肉萎縮的病理機(jī)制，為進(jìn)一步探尋更有效的治療手段提供一定的理論依據(jù)。

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)分析對SCI 后第2 d 和第5 d 的股外側(cè)肌活檢進(jìn)行基因表達(dá)圖譜差異分析，并構(gòu)建了lncRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選出關(guān)鍵調(diào)控基因，并利用大鼠進(jìn)行了RT-qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為SCI 肌肉萎縮的治療提供新的靶點(diǎn)及方向。

GO 富集分析顯示，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵mRNA 主要參與了樹突、神經(jīng)元胞體、神經(jīng)元細(xì)胞核周體、細(xì)胞膜、核膜、質(zhì)膜等細(xì)胞成分的調(diào)節(jié)，說明其與SCI 后的神經(jīng)元重塑、信號傳遞息息相關(guān)；在分子功能水平主要參與調(diào)節(jié)蛋白激酶、連接酶、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及受體的活性，參與肌動蛋白的結(jié)合，提示其與肌細(xì)胞的合成及信號傳遞可能密切相關(guān)；在生物過程層面，主要參與了細(xì)胞的增殖、血管生成、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、一氧化氮合酶合成的正向調(diào)控、PI3K 信號的正向調(diào)控，提示其可能與細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞自噬及抑制凋亡密切相關(guān)，從而有助于神經(jīng)元的恢復(fù)?？偠灾?，GO 富集分析提示，關(guān)鍵mRNA 可能主要是通過影響神經(jīng)元的生成、信號傳遞來影響SCI 后發(fā)生的肌肉萎縮。

KEGG 通路富集分析顯示，關(guān)鍵基因主要參與缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）信號通路和腫瘤中的程序性死亡配體1（PD-L1）表達(dá)和程序性死亡蛋白1（PD-1）檢查點(diǎn)通路的調(diào)控。HIF-1 是一種轉(zhuǎn)錄因子，由HIF-1α 和HIF-1β 兩個亞基組成，在O2充足的條件下，脯氨酸殘基402 和/或脯氨酸殘基-564 利用O2和α-酮戊二酸作為底物通過脯氨酸羥化酶結(jié)構(gòu)域蛋白2 羥化HIF-1α，導(dǎo)致E3 泛素化，引起蛋白酶體亞基降解。相反，在缺氧條件下，HIF-1α 與p300/ CBP 結(jié)合，充當(dāng)許多缺氧誘導(dǎo)基因的主調(diào)節(jié)因子。研究表明，鐵死亡在SCI 中具有重要的作用，而HIF-1 信號通路里的5 個基因（Stat3、Tlr4、Hmox1、Hif1α 和Cybb）在鐵死亡里具有重要調(diào)控作用［19］。蛋白質(zhì)脫乙酰化在SCI 繼發(fā)性損傷中扮演著重要角色，會進(jìn)一步加重SCI，而三乙酸甘油可能通過HIF-1 信號通路促進(jìn)蛋白質(zhì)乙?；?，抑制神經(jīng)元炎癥反應(yīng)、凋亡［20］；同樣的，其他研究亦表示HIF-1 信號通路在SCI 后繼發(fā)性損傷具有重大意義［21，22］，提示該通路有可能成為SCI 及肌肉萎縮治療的新靶點(diǎn)。PD-1 是一種免疫抑制分子，PD-1 及其配體PD-L1 可以通過調(diào)節(jié)T 細(xì)胞和B 細(xì)胞對人體細(xì)胞的反應(yīng)程度，以及通過抑制T 細(xì)胞炎癥反應(yīng)來維持生物體對免疫系統(tǒng)的自我耐受性。研究顯示，PD-1 和PD-L1 在SCI 后小膠質(zhì)細(xì)胞上顯著表達(dá)，在炎性過程中具有重要意義，敲低PD-1 表達(dá)會加劇SCI 后的炎癥反應(yīng)［23，24］；右美托咪定可通過上調(diào)PD-1 表達(dá)減輕神經(jīng)炎癥［25］，提示該通路可能主要是通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元的炎癥來影響SCI 進(jìn)程。綜上，一些關(guān)鍵mRNA 可能是通過HIF-1 信號通路和PD-L1 表達(dá)和PD-1 檢查點(diǎn)通路來影響神經(jīng)元細(xì)胞的炎癥反應(yīng)而參與SCI 后肌肉萎縮的發(fā)生，這些機(jī)制可為SCI后肌肉萎縮的治療研究提供了新的方向及目標(biāo)。

本研究利用DEmRNA、DElnRNA 和結(jié)合miRcode、miRWalk 、Targetscan 及miRDB 數(shù)據(jù)庫預(yù)測構(gòu)建了lncRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)后，最終篩選出4 個關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示相對于對照組，觀察組的miR-17-5p、miR-20b-5p 表達(dá)量升高，KCNK10、PCDHA3 表達(dá)量降低，與生物信息學(xué)預(yù)測的結(jié)果一致。既往研究表明，SCI 后miR-17-5p 表達(dá)水平上調(diào)，合成miR-17-5p 模擬物能夠挽救Dicer1-null 星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖缺陷，而miR-17-5p 的抑制劑能夠阻斷脂多糖誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，其引發(fā)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖可能是通過JAK / STAT3途徑來調(diào)控［26］；間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）能夠緩解SCI，是SCI 治療的研究熱點(diǎn)之一，Yue 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-A mRNA 能與miR-17-5p 特異性結(jié)合，敲低VEGF-A 后，SCI 小鼠的脊髓完整組織減少，而敲低miR-17-5p 則顯示出相反的結(jié)果，表明抑制miR-17-5p 的表達(dá)可以上調(diào)MSCs 中VEGF-A 的表達(dá)，促進(jìn)MSCs 對脊髓損傷的修復(fù)；Zhang 等［28］發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-17-5p 表達(dá)會促進(jìn)神經(jīng)元軸突的生長，而STAT3 磷酸化抑制劑AG490 會逆轉(zhuǎn)這種促進(jìn)，驗(yàn)證了miR-17-5p 可以通過靶向STAT3 / GAP-43 途徑調(diào)節(jié)皮質(zhì)神經(jīng)元軸突生長，表明miR-17-5p 在神經(jīng)元軸突的生長中起關(guān)鍵的調(diào)控作用。在本研究中，觀察組的miR-17-5p 表達(dá)量上調(diào)，與其他學(xué)者相關(guān)報道一致，提示SCI 后肌肉萎縮可能與神經(jīng)的功能障礙、軸突生長異常有關(guān)。Wang 等［29］通過生物信息學(xué)分析后認(rèn)為miR-20b-5p 可能是SCI 患者的潛在生物標(biāo)志物；研究表明，miR-20b-5p 能夠通過與淀粉樣蛋白β 前體蛋白（APP）相結(jié)合達(dá)到干擾鈣穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)軸突生長的作用，這在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有重要意義［30］；同樣的，另一項(xiàng)研究表明，抑制miR-20b-5p 表達(dá)，可靶向調(diào)節(jié)RhoC，減弱PC12 細(xì)胞中Aβ25-35 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，在神經(jīng)細(xì)胞的凋亡調(diào)控中發(fā)揮著重要作用［31］。在本研究中，miR-20b-5p 表達(dá)量上調(diào)，與相關(guān)研究報道一致，提示SIC 后的肌肉萎縮可能與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡相關(guān)。KCNK10 是串聯(lián)孔域鉀通道家族的成員，在穩(wěn)定負(fù)靜息膜電位和平衡去極化方面起著重要作用。Haenisch 等［32］發(fā)現(xiàn)，KCNK10 是miRNA-187-3p 的靶基因，miRNA-187-3p 能夠負(fù)調(diào)控KCNK10 的表達(dá)，KCNK10 表達(dá)上調(diào)具有保護(hù)作用，能夠?qū)π切文z質(zhì)細(xì)胞鉀和谷氨酸穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生有益影響；同樣的Zhao 等［33］發(fā)現(xiàn)異氟醚預(yù)處理對缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用與KCNK10 通道激活的增加有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，KCNK10 表達(dá)量下調(diào)，可能是神經(jīng)出現(xiàn)損傷后，KCNK10 通道激活不足，導(dǎo)致神經(jīng)損傷不能及時控制，從而加重疾病程度。PCDHA3 是原鈣粘蛋白α 基因簇的成員，是一種類似于B 細(xì)胞和T 細(xì)胞受體基因簇的不尋?；蚪M結(jié)構(gòu)，很有可能在大腦中特定細(xì)胞-細(xì)胞連接的建立和功能以及神經(jīng)元細(xì)胞黏附起關(guān)鍵作用［34，35］。在此次實(shí)驗(yàn)中，PCDHA3 表達(dá)下調(diào)，提示肌肉萎縮可能與細(xì)胞間的連接構(gòu)建功能障礙有關(guān)。綜上，miR-17-5p、miR-20b-5p、KCNK10、PCDHA3 等調(diào)控、表達(dá)方面的研究，可能是SCI 后肌肉萎縮相關(guān)機(jī)制值得深入探討的方向之一。

綜上所述，在SCI 后肌肉組織中發(fā)現(xiàn)miR-17-5p、miR-20b-5p、KCNK10、PCDHA3 存在顯著的差異表達(dá)，提示這些基因可能是SCI 后肌肉萎縮的關(guān)鍵基因，有望為SCI 后肌肉萎縮的診療及康復(fù)提供新的研究靶點(diǎn)及方向。但該研究仍存在一定的局限性。首先，由于目前GEO 數(shù)據(jù)庫上對于SCI 后肌肉萎縮的數(shù)據(jù)相對較少，樣本量有限，研究結(jié)果可能具有一定的偏倚；其次，構(gòu)建的SCI 后肌肉萎縮lncRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)缺乏有效的證據(jù)證明調(diào)控網(wǎng)絡(luò)間的調(diào)控關(guān)系，需要進(jìn)一步進(jìn)行雙熒光素酶、pull down 等技術(shù)開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步驗(yàn)證lncRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控模式的體內(nèi)外生物學(xué)機(jī)制；再者，由于lncRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)里面的lncRNA 都是人源的，在鼠源上沒有找到相應(yīng)的基因序列，未能驗(yàn)證其表達(dá)變化是否跟生物信息學(xué)預(yù)測的一致。但總的來說，此次實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步探討SCI 后肌肉萎縮的作用機(jī)制及治療靶點(diǎn)提供了一定的參考方向。

作者貢獻(xiàn)度說明：

劉付春：論文撰寫、實(shí)驗(yàn)設(shè)計及數(shù)據(jù)分析，許建文：參與指導(dǎo)、修改論文，李筱璐、劉青青：部分?jǐn)?shù)據(jù)整理、圖表制作，張寅偉、桂裕昌：動物造模、取材。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。