武定雞抗馬立克氏病相關(guān)基因的研究進(jìn)展

周 勇 張 健 楊斯涵 王皓然 楊亮宇 何云波

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 650201 2.昆明市宜良縣匡遠(yuǎn)畜牧獸醫(yī)站，云南昆明 650201）

武定雞是全國(guó)著名的地方雞種，屬肉用型，以體型大、肉質(zhì)鮮、外觀美等特點(diǎn)聞名，主要分布于云南省的武定、祿勸等地。當(dāng)?shù)孛癖娫谄滹曫B(yǎng)過(guò)程中恪守“只向外賣雞，不向外買雞”的鄉(xiāng)規(guī)民約，使雞群長(zhǎng)期處于自繁自養(yǎng)的封閉狀態(tài)。由于繁殖過(guò)程中自然環(huán)境的封閉和人為因素的干預(yù)，使其基因更具原始性和保守性，從而更能保留獨(dú)特的基因型。

馬立克氏?。∕D）是由皰疹病毒科B亞群馬立克氏病病毒（MDV）引起的雞的一種淋巴組織增生性腫瘤病，與雞新城疫、傳染性法氏囊病并稱為危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的三大主要疫病。目前，MD主要防控措施是對(duì)雞進(jìn)行MDV不同血清型疫苗的接種，但近年來(lái)MDV毒力不斷增強(qiáng)，已發(fā)現(xiàn)其超強(qiáng)毒株可以突破CVI988疫苗的保護(hù)，正如Kreager提出的每種MDV疫苗使用期只有10年。為彌補(bǔ)疫苗免疫的不足，許多學(xué)者對(duì)雞MD抗性基因進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)主要組織相容性復(fù)合體（MHC）、生長(zhǎng)素（GH）基因和數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）等為其抗性基因。而我們?cè)趯?duì)武定雞易發(fā)病調(diào)查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)時(shí)有MD出現(xiàn)且不同雞群發(fā)病情況差異明顯?；诖耍疚木湍壳把芯堪l(fā)現(xiàn)的MD抗性基因進(jìn)行綜述，總結(jié)前人有效的檢測(cè)方法，為武定雞MD抗性相關(guān)基因的研究提供參考。

1 主要組織相容性復(fù)合體（MHC）

雞MHC亦稱B復(fù)合體[1]，分為B復(fù)合體和Rfp-y基因，位于第16號(hào)染色體，編碼能引起機(jī)體異體排斥反應(yīng)抗原系統(tǒng)的一組高度多態(tài)性的基因群。雞B復(fù)合體主要由B-F、B-L和B-G三個(gè)功能性基因組成，B-F和B-L所編碼的抗原在結(jié)構(gòu)和功能上分別類似于哺乳動(dòng)物MHCⅠ類和Ⅱ類抗原，B-G抗原為禽類所特有。Bacon[2]在對(duì)雞群中不同MHC-B單倍型對(duì)MD抗性差異性研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)對(duì)MD抗性最強(qiáng)的是B21單倍型，中等為B2和B6單倍型，易感為B9、B13和B15單倍型。

1.1 B-F基因

B-F基因編碼MHCⅠ類抗原，由α鏈基因組成。α鏈基因有八個(gè)外顯子包括：一個(gè)編碼信號(hào)序列外顯子；二個(gè)編碼胞外區(qū)外顯子；一個(gè)編碼轉(zhuǎn)膜區(qū)外顯子；二個(gè)參與編碼胞質(zhì)尾區(qū)外顯子以及3'-UTR區(qū)和5'-UTR區(qū)的編碼外顯子組成。雞B-F基因與細(xì)胞免疫關(guān)系密切，對(duì)MD、禽白血病、雞瘟等多種疾病有抗性[3]。

Briles等[4]以Cornell品種抗MD的N系和易感P系雞群作為研究對(duì)象，其中P系由B19和B13的單倍型組成，N系僅含B21單倍型。通過(guò)兩個(gè)品系的雜交F1代中B19/B21的母雞與B19/Bl9的公雞回交后，經(jīng)MDV攻毒后，發(fā)現(xiàn)其子代B19/B19的MD發(fā)病率約是B19/B21的三倍；將F1代中B19/B21的公雞與B19/Bl9的母雞回交后，經(jīng)MDV攻毒后，其子代B19/B19的MD發(fā)病率約是B19/B21的六倍。結(jié)果表明B21單倍型對(duì)MD的抗性遠(yuǎn)高于B19單倍型。隨后，Briles等[5]又利用MDV強(qiáng)毒株對(duì)重組單倍型B19/B19、B19/B21和B19/BF21-G19的小雞攻毒，發(fā)現(xiàn)B19/B21和B19/BF21-G19的MD發(fā)生率遠(yuǎn)低于B19/B19單倍型，表明B-F亞區(qū)是MD抗性基因。

后來(lái)，Rogers等[6]對(duì)位于B-F/L區(qū)域的NK細(xì)胞受體樣蛋白基因研究，認(rèn)為其可作為MDV抗性的候選基因；Jin等[7]在對(duì)抗MD純合子霞煙雞B-F基因多態(tài)性分析時(shí)，利用RFLP技術(shù)分析了霞煙雞的B6、B19和B21單倍型，發(fā)現(xiàn)B21單倍型對(duì)MDV抗性最高，B6單倍型對(duì)MDV抗性相對(duì)較弱，B19單倍型對(duì)MDV抗性最弱，結(jié)果表明不同B單倍型對(duì)MDV抗性差異明顯；隨后Jin等[8]對(duì)不同單倍型的B-F1/B-F2基因序列測(cè)定比較中，發(fā)現(xiàn)序列中多態(tài)性主要表現(xiàn)在B-F基因的α1α2區(qū)域；左天榮[9]在對(duì)抗MD霞煙雞與非抗MD霞煙雞B-F基因序列的研究中，利用B-F基因的α1α2區(qū)域設(shè)計(jì)引物，并確定目的片段為567 bp，PCR反應(yīng)產(chǎn)物測(cè)序后與Genbank公布的 B2、B6、B5、B13、B19、B21和B21-LIKE單倍型基因序列進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域內(nèi)堿基替換頻繁并呈高度多態(tài)性，并證明抗MD霞煙雞與非抗雞在此區(qū)域存在基因差異。

1.2 B-L基因

B-L基因編碼MHCⅡ類抗原，由α鏈和β鏈基因組成。α鏈基因無(wú)多態(tài)性；β鏈基因有豐富的多態(tài)性包括：一個(gè)編碼信號(hào)序列區(qū)外顯子；二個(gè)編碼細(xì)胞質(zhì)區(qū)外顯子；編碼非多態(tài)性β2免疫球蛋白的區(qū)域；編碼β蛋白和肽結(jié)合區(qū)的多態(tài)性區(qū)域以及3'-UTR區(qū)的編碼外顯子。雞B-L基因與體液免疫關(guān)系密切，對(duì)MD、球蟲(chóng)病等多種疾病有抗性[3]。

Pharr等[10]通過(guò)對(duì)B-L基因表達(dá)的研究，證明不同品種同一品系B2、B5、B13、B15和B21單倍型雞的B-L基因表達(dá)程度不同，且對(duì)MD抗性也不相同，說(shuō)明B-L基因多態(tài)性與MD抗性相關(guān)；Niikura等[11]通過(guò)對(duì)MDV不同編碼蛋白與宿主蛋白交互作用的研究，發(fā)現(xiàn)只有B-L基因的β鏈基因編碼的蛋白是與MDV有交互用，表明β鏈?zhǔn)菦Q定MD抗性的主要影響因素。

隨著對(duì)雞B-F和B-L基因研究的深入，F(xiàn)ulton等[12]在總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行了雞MHC分子基因型鑒定，通過(guò)多個(gè)研究機(jī)構(gòu)長(zhǎng)期隔離培育的不同品系MHC純合子單倍型雞群為研究材料，對(duì)B-F和B-L基因區(qū)域間微衛(wèi)星位點(diǎn)LEI0258和MCW0371分別設(shè)計(jì)引物，通過(guò)其PCR產(chǎn)物不同來(lái)確定大多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)單倍型。LEI0258的PCR目的片段從182到552 bp，與其對(duì)應(yīng)的個(gè)單倍型如圖1，MCW0371的PCR目的片段從200到209 bp。

圖1 LEI0258微衛(wèi)星位點(diǎn)PCR產(chǎn)物與部分單倍型

通過(guò)結(jié)合分析LEI0258和MCW0371微衛(wèi)星位點(diǎn)PCR目的產(chǎn)物，F(xiàn)ulton確定了雞的各主要標(biāo)準(zhǔn)單倍型，各單倍型目的片段大小詳見(jiàn)表1。而與MD抗性相關(guān)的B2、B6、B5、B13、B19和B21單倍型，也可以通過(guò)此法進(jìn)行區(qū)分。

表1 LEI0258和MCW0371的PCR目的產(chǎn)物與各標(biāo)準(zhǔn)單倍型

1.3 B-G基因

B-G基因包括3'-UTR區(qū)、5'-UTR區(qū)和五個(gè)外顯子，其外顯子包括：一個(gè)編碼信號(hào)肽的外顯子；一個(gè)編碼胞外區(qū)顯子；一個(gè)編碼胞內(nèi)區(qū)外顯子；一個(gè)編碼跨膜區(qū)外顯子以及一個(gè)編碼鏈接區(qū)外顯子。由于雞紅細(xì)胞表面B-G抗原具有顯著的多態(tài)性，早期學(xué)者以血清型不同來(lái)鑒別單倍型的不同，并成功選育出了抗MD雞群。但B-G抗原只能協(xié)助MHC I和II類抗原進(jìn)行體液免疫應(yīng)答無(wú)特定MD抗性，因此越來(lái)越多的學(xué)者已不再將其作為MD抗性基因。

1.4 Rfp-y基因

Rfp-y基因與B復(fù)合體相似，二者雖然位于同一條染色體上，但無(wú)遺傳上的聯(lián)系。Tanja等[13]在對(duì)黑琴雞Rfp-y基因研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)Rfp-y基因表達(dá)量的不同對(duì)腫瘤發(fā)生率有影響，由此推斷Rfp-y基因可能與MD抗性相關(guān)。但在Cornell品種抗MD的N系和易感P系雞群及其他幾個(gè)品種中，并未表現(xiàn)出Rfp-y基因?qū)δ[瘤發(fā)生率的影響。因此，Rfp-y基因與MD抗性是否有關(guān)尚無(wú)明確定論。

2 生長(zhǎng)素（GH）基因

雞GH基因由五個(gè)外顯子和四個(gè)內(nèi)含子組成，外顯子穩(wěn)定而內(nèi)含子易突變，故推測(cè)內(nèi)含子是其表達(dá)的主要影響因素。GH有促進(jìn)雞生長(zhǎng)發(fā)育和免疫調(diào)節(jié)的作用，研究發(fā)現(xiàn)MDV抗性雞體型通常較小，表明GH分泌水平有可能與MDV復(fù)制或腫瘤的形成相關(guān)。Liu[14]利用酵母雙雜交試驗(yàn)、免疫組織試驗(yàn)和間接免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)GH基因與MD抗性相關(guān)；Sarson等[15]在對(duì)MD抗性和易感雞的GH基因轉(zhuǎn)錄分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)GH基因表達(dá)存在差異，并由此推斷其為MD抗性基因，但對(duì)MD抗性有多大，仍需要進(jìn)一步研究。

3 數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）

QTL是指一個(gè)性狀由多個(gè)基因決定，每個(gè)基因?qū)Υ诵誀钣绊懚际俏⑿У?。McElrov等[16]利用2個(gè)MD病死率不同的雞群雜交得到F1代，再將F1代回交，對(duì)F1代回交得到的雞群經(jīng)MD疫苗免疫后，通過(guò)選擇性DNA池技術(shù)選出81個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)了17個(gè)與MD抗性有關(guān)的微衛(wèi)星位點(diǎn)；Heifetz等[17]在對(duì)包括雞2/3基因圖譜的198微衛(wèi)星位點(diǎn)研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)了15個(gè)與MD抗性相關(guān)的非MHC染色體區(qū)域，它們分別位于1、2、3、4、5、7、8和9號(hào)染色體以及Z染色體上。

4 其他基因

Li等[18]通過(guò)對(duì)MD易感雞與抗性雞的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因進(jìn)行酶切，得到7個(gè)等位基因型出現(xiàn)頻率存在差異；Kaiser等[19]通過(guò)對(duì)ADOL品系MD易感和抗性雞脾細(xì)胞中IL-6和IL-18的mRNA表達(dá)水平的研究，發(fā)現(xiàn)易感雞表達(dá)水平遠(yuǎn)高于抗性雞，表明IL-6和IL-18與MD抗性密切相關(guān)；Fei等[20]通過(guò)對(duì)RCS品系MD易感和抗性雞感染MDV后，發(fā)現(xiàn)易感雞與抗性雞的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因3a和3b表達(dá)量存在差異，說(shuō)明它們可能與MD抗性相關(guān)。但上述結(jié)果是否適應(yīng)于雞的大多數(shù)品種，還有待研究。

5 結(jié)語(yǔ)

與雞MD抗性相關(guān)的多個(gè)基因中，MHC的B-F和B-L基因無(wú)疑是MD抗性最主要的影響因素，非MHC基因?qū)D抗性通常僅表現(xiàn)在幾個(gè)雞群中且同一基因在不同品系中差別較大。因此，先前的學(xué)者也都將研究重點(diǎn)放在了B-F和B-L基因上，特別是Fulton通過(guò)B-F和B-L基因區(qū)域間微衛(wèi)星位點(diǎn)PCR產(chǎn)物來(lái)區(qū)分不同的單倍型，為我們研究武定雞MD抗性相關(guān)基因提供了新思路。但研究者們往往只注重對(duì)其中一個(gè)基因的研究，同時(shí)又常忽略非MHC基因的影響，對(duì)雞MD抗性相關(guān)基因的認(rèn)識(shí)始終沒(méi)有形成一個(gè)完整的體系。由此可知，綜合考慮各相關(guān)基因?qū)D抗性的影響將是下一步研究趨勢(shì)，而武定雞由于其品種和生長(zhǎng)環(huán)境的獨(dú)特性，以其作為研究對(duì)象更有生物學(xué)意義。

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