奶牛結(jié)核桿菌病檢測(cè)方法的研究

俞小紅

（蘇州市畜牧獸醫(yī)站，江蘇蘇州 215128）

近年來(lái)，隨著人們生活水平的日益提高，人們對(duì)牛肉、奶制品，特別是牛奶的需求與日俱增，為了保證百姓能喝上放心奶，各級(jí)政府高度重視，出臺(tái)了一系列凈化奶牛結(jié)核病的政策和措施。據(jù)統(tǒng)計(jì)，人結(jié)核病有10%以上由牛分支桿菌引起，我國(guó)是世界上結(jié)核病發(fā)病較嚴(yán)重的國(guó)家。因此，牛結(jié)核病的傳染流行嚴(yán)重影響到畜牧業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，更嚴(yán)重威脅著人類的健康。

本文對(duì)蘇州地區(qū)部分奶牛場(chǎng)結(jié)核桿菌病檢測(cè)方法進(jìn)行了比較研究，為摸清適合本地區(qū)奶牛結(jié)核桿菌病的檢測(cè)方法提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究材料

1.1.1 儀器設(shè)備

酶標(biāo)儀、烘箱、離心機(jī)、微量震蕩器、水浴箱、游標(biāo)卡尺等。

1.1.2 試驗(yàn)材料

（1）試劑：國(guó)產(chǎn)牛型提純結(jié)核菌素（PPD），購(gòu)自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，50頭份/瓶；BOVIGAMTM牛結(jié)核分支桿菌γ-干擾素檢測(cè)試劑盒；由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院提供。

（2）試驗(yàn)動(dòng)物：吳中區(qū)、相城區(qū)、常熟市的重點(diǎn)陽(yáng)性奶牛場(chǎng)。根據(jù)試驗(yàn)需要并結(jié)合牛場(chǎng)實(shí)際，本試驗(yàn)共選取了478頭奶牛作為試驗(yàn)樣本。

1.2 試驗(yàn)內(nèi)容和方法

1.2.1 試驗(yàn)內(nèi)容

奶牛結(jié)核桿菌病檢測(cè)：分別用牛型結(jié)核分支桿菌（PPD）皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和BOVIGAMTM IFN-γ（γ-干擾素）試驗(yàn)檢測(cè)牛結(jié)核病，來(lái)比較皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和γ-干擾素檢測(cè)這2種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

1.2.2 檢測(cè)方法

（1）牛型結(jié)核分支桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)：參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)（GB/T18645-2002）》進(jìn)行。

（2）BOVIGAMTM IFN-γ（γ-干擾素）試驗(yàn)：具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

（1）用牛結(jié)核分支桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和BOVIGAMTM IFN-γ（γ-干擾素）試驗(yàn)分別對(duì)478頭奶牛進(jìn)行了牛結(jié)核桿菌的檢測(cè)，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 牛結(jié)核分支桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和IFN-γ體外釋放檢測(cè)（牛型和禽型）的比較

（2）兩種檢測(cè)方法的比較：從表1中可以看出，82頭牛結(jié)核菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)陽(yáng)性牛中檢出IFN-γ牛型結(jié)核陽(yáng)性41頭，禽型結(jié)核13頭。396頭牛結(jié)核菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)陰性牛中檢出IFN-γ干擾素牛型結(jié)核陽(yáng)性58頭，禽型結(jié)核9頭，陰性牛329頭。牛結(jié)核菌素PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的陽(yáng)性檢出率為17.2%（82/478），IFN-γ干擾素試驗(yàn)牛型結(jié)核陽(yáng)性檢出率為20.7%（99/478）；2種方法的陽(yáng)性符合數(shù)為41頭，陽(yáng)性符合率為45.3%（82/181）；陰性符合數(shù)為329頭，陰性符合率為87.4%（658/753）。兩者的總體符合率為77.4%（370/478）。

以IFN-γ干擾素試驗(yàn)作為結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，99頭IFN-γ干擾素試驗(yàn)陽(yáng)性牛中，牛結(jié)核菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢出的陽(yáng)性牛為41頭，敏感性為41.4%（41/99）；357頭IFN-γ干擾素試驗(yàn)陰性牛中牛結(jié)核菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢出的陰性牛為329頭，特異性為92.2%（329/357）。

3 小結(jié)與討論

（1）通過(guò)牛結(jié)核菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和IFN-γ干擾素試驗(yàn)2種方法的比較（表1），可以看出，IFN-γ干擾素試驗(yàn)陽(yáng)性檢出率高于PPD反應(yīng)，且能區(qū)分牛型和禽型感染，PPD反應(yīng)敏感性較IFN-γ干擾素試驗(yàn)低，無(wú)法排除禽型、副結(jié)核等其他分支桿菌的干擾，兩者的陰性符合率為87.4%，表明2種方法具有較好的陰性符合率。

目前，我國(guó)牛結(jié)核病檢疫，主要采用牛型PPD進(jìn)行皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)，但從表1檢測(cè)數(shù)據(jù)來(lái)看存在一定比例的禽結(jié)核感染，是由禽結(jié)核分枝桿菌感染引起的假陽(yáng)性。主要是由于PPD反應(yīng)所用的診斷試劑結(jié)核菌素純蛋白衍生物（PPD）是多種抗原的混合物，存在交叉反應(yīng)導(dǎo)致非特異性陽(yáng)性反應(yīng)。若單獨(dú)用該方法檢出PPD陽(yáng)性牛即實(shí)行“檢疫-撲殺”淘汰措施，會(huì)導(dǎo)致部分假陽(yáng)性牛被誤殺。同時(shí)該方法敏感性（41.4%）較低，在疫病的早期階段和急性感染病例會(huì)發(fā)生假陰性反應(yīng)[1]，又會(huì)導(dǎo)致?lián)錃⒉粌簟９蔕IE認(rèn)為僅用單一的結(jié)核菌素試驗(yàn)進(jìn)行結(jié)核病凈化很難[2]，而且PPD反應(yīng)由于受遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響，在30 d內(nèi)不能進(jìn)行復(fù)檢，易造成該病的擴(kuò)散和疫情處置的延誤，IFN-γ干擾素試驗(yàn)則不存在復(fù)檢時(shí)間的限制。

（2）從表1中可以看出，PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)在實(shí)際檢測(cè)中的敏感性相對(duì)比較差。實(shí)際操作中，牛型結(jié)核菌素的質(zhì)量、劑量、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)及操作方法等因素均受主觀判斷影響。但該方法比較成熟，檢測(cè)起來(lái)較直觀，不需要精密的試驗(yàn)儀器和特殊的實(shí)驗(yàn)條件，臨床實(shí)用性和可操作性比較強(qiáng)，因此，適用于在基層應(yīng)用和結(jié)核病的普查初篩工作。

IFN-γ干擾素試驗(yàn)是檢測(cè)血漿中抗原含量的一種方法。刺激淋巴細(xì)胞所用的抗原是結(jié)核分枝桿菌中存在的特異性抗原，有牛型和禽型之分，可以有效區(qū)分牛分支桿菌和環(huán)境中禽的干擾[3]，因該方法有較高的特異性；而由特異性抗原進(jìn)行刺激所產(chǎn)生的γ干擾素的量直接反映機(jī)體是否接觸過(guò)結(jié)核桿菌，因此，具有較高的敏感性[4]。該方法克服了皮試變態(tài)反應(yīng)的主觀性和禽型的干擾，而且陽(yáng)性檢出率高，但成本較高，需要一定的實(shí)驗(yàn)條件和檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于我國(guó)基層檢疫不適用，難以推廣應(yīng)用，故在一定的條件下，特別是針對(duì)重點(diǎn)陽(yáng)性牛場(chǎng)、普查和引進(jìn)新奶牛時(shí)，可將PPD和抗原特異性IFN-γ干擾素檢測(cè)方法聯(lián)合應(yīng)用于奶牛結(jié)核病的檢疫，將有效提高檢測(cè)方法的特異性和準(zhǔn)確度，減少不必要的經(jīng)濟(jì)損失。

（3）我們通過(guò)對(duì)蘇州地區(qū)部分奶牛場(chǎng)結(jié)核桿菌檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)分析和臨床檢測(cè)應(yīng)用的比較，為摸清適合本地區(qū)奶牛結(jié)核病的檢測(cè)方法提供了可靠的科學(xué)依據(jù)，為解決近年來(lái)奶牛結(jié)核病檢測(cè)和凈化方法的難題提供了有效的途徑。通過(guò)2種檢測(cè)方法的聯(lián)合運(yùn)用可以有效降低由于檢測(cè)結(jié)果的誤判導(dǎo)致的假陽(yáng)性和假陰性造成的誤殺奶牛數(shù)量和撲殺不凈現(xiàn)象，并可大大減少由此帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。進(jìn)一步做好檢疫、早隔離淘汰陽(yáng)性牛和凈化工作，將有效促進(jìn)結(jié)核病的凈化及健康奶牛群的建立，從而更好的服務(wù)于社會(huì)。

[1]徐賢坤.兩種奶牛結(jié)核病檢測(cè)方法的比較[J].畜牧與獸醫(yī)，2010，42（2）：33.

[2]世界動(dòng)物衛(wèi)生組織.陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)（哺乳動(dòng)物、禽鳥和蜜蜂）[M].北京：農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局，中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，2007.

[3]Alicia A，Lucia DE，Bezos J，et al.Assessment of diagnostic tools for eradication of bovine tuberculosis in cattle co-infected with Mycobacterium bovis and M.avium subsp[J].Paratuberculosis Vet Res，2006，（37）：596-606.

[4]鄧銓濤，陳穎玉，郭愛(ài)珍，等.奶牛結(jié)核病診斷方法的比較研究.生物技術(shù)通報(bào)，2009，（3）：84-87.