超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)雞肉中藥物殘留量

陳 娟 羅 艷 吳春燕 馬 巖 楊俊華

（1.寧夏獸藥飼料監(jiān)察所，寧夏銀川 750011；2.寧夏農(nóng)墾農(nóng)林牧技術(shù)推廣服務(wù)中心，寧夏銀川 750011）

氯霉素類藥物是一種廣譜抑菌性抗生素，對(duì)革蘭氏陽性菌和陰性菌都有作用，臨床是治療傷寒桿菌、副傷寒桿菌、沙門氏菌感染的首選藥。代表性藥物主要有氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考。由于氯霉素會(huì)抑制骨髓造血功能，造成再生障礙性貧血，所以，很多國(guó)家都已經(jīng)禁止在食用性動(dòng)物上使用氯霉素。甲砜霉素不產(chǎn)生再生障礙性貧血，但抑制紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板的生成。歐盟、美國(guó)禁用于食品動(dòng)物。氟苯尼考抗菌活性優(yōu)于氯霉素、甲砜霉素，對(duì)氯霉素耐藥的菌株仍敏感不引起骨髓抑制或再生障礙性貧血，但有胚胎有毒性，妊娠動(dòng)物禁用，在雞肉中的殘留限量為100 μg/kg。本研究擬采用LC-MS/MS方法建立雞肌肉中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考3種藥物的多殘留檢測(cè)方法，以期為該類藥物的殘留監(jiān)控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

ACQUITY UPLC-Xevo TQ超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，Waters公司；AE-205電子天平，Mettler Toledo公司；CT15RT高速冷凍離心機(jī)，日立公司；Organomation Associates 氮吹儀，Jnc公司；MS1旋渦合器，IKA公司；LR4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，Heidolph公司。

1.2 試劑與材料

對(duì)照品：氯霉素、氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)物，純度大于95%，Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲砜霉素、氟苯尼考，純度大于95%，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；甲醇為Fisher公司；乙酸乙酯為色譜純；正己烷為色譜純；水為超純水；氨水為分析純。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和工作液的配制

精密稱取氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考對(duì)照品各10 mg，分別置100 ml容量瓶中，甲醇溶解并稀釋成100 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；分別準(zhǔn)確吸取三種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，置于10 ml容量瓶中，用甲醇稀釋成適宜濃度的中間混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。準(zhǔn)確吸取適量氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)物儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成適宜濃度的中間濃度內(nèi)標(biāo)溶液。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確吸取適量中間混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和中間濃度內(nèi)標(biāo)溶液，用空白樣品提取液配成系列濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，氯霉素系列濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L，甲砜霉素和氟苯尼考系列濃度為2.0、4.0、8.0、20.0、40.0 μg/L，內(nèi)標(biāo)物濃度為5 μg/L。從低濃度到高濃度測(cè)定，每一濃度進(jìn)樣3針，以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 UPLC-MS/MS分析條件 色譜條件

色譜柱為Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A為甲醇，B為水，梯度洗脫：0～6 min，10%A線性變化至90%A；6～7 min，90%A線性變化至10%A，保持1.9 min。流速0.3 ml/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量10 μl。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI-），毛細(xì)管電壓2.8 KV，源溫150 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃，霧化氣流速1 000 L/h，錐孔氣流速50 L/h。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)各離子對(duì)及對(duì)應(yīng)錐孔電壓、碰撞能量見表1。

表1 3種藥物的定性、定量離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量

1.6 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取均質(zhì)后的試料（2+0.05）g，置于50 ml離心管內(nèi)，加入20 ng/ml D5-氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液250 μl，加入乙酸乙酯15 ml，再加入0.45 ml氨水，5 g無水硫酸鈉，旋渦混勻，超聲提取5 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液于雞心瓶中，重復(fù)提取一次，合并提取液于雞心瓶看，45℃旋轉(zhuǎn)蒸干。殘留物用1 ml水溶解，再加入3 ml正己烷旋渦混合30 s，靜置分層。棄去上層正己烷，再加入3 ml正己烷旋渦混合30 s，靜置分層，移取下層水相于1.5 ml離心管中，以13 000 r/min離心5 min，過0.2 μm濾膜后，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

2 結(jié)果

2.1 方法線性

準(zhǔn)確量取適量的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，制得濃度為0.5、1、2、5、10 μg/L氯霉素基質(zhì)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)系列工作液（內(nèi)標(biāo)濃度為5 μg/L）、甲砜霉素及氟苯尼考基質(zhì)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)系列工作液2、4、8、20、40 μg/L（內(nèi)標(biāo)濃度為5 μg/L），依次上機(jī)測(cè)定，以各藥物定量離子質(zhì)量色譜峰面積與對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（y），標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程（表2）。三種藥物在系列濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.99。

圖1 甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 氯霉素素標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 3種藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

2.2 方法精密度與準(zhǔn)確度

在空白雞肌肉中添加氯霉素0.25 ug/kg、0.5 ug/kg、1 ug/kg及甲砜霉素、氟苯尼考1 ug/kg、2 ug/kg、4 ug/kg 3個(gè)不同濃度進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果匯總見表3。可以看出，氯霉素的平均回收率為94.0%～96.9%，批內(nèi)批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%；甲砜霉素平均回收率為87.4%～98.2%，批內(nèi)批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%；氟苯尼霉平均回收率為99.5%～103%，批內(nèi)批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。

圖5 0.25ng/g（1ng/g）空白雞肌肉添加3種藥物的特征離子質(zhì)量色譜圖

表3 空白雞肌肉中添加3種藥物的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）同時(shí)測(cè)定雞肉中3種氯霉素類藥物，方法線性、回收率和精密度等得到參數(shù)均能滿足獸藥殘留分析方面的要求。

[1]孫雷，張?bào)P，王樹槐，等.超高效液相色譜法—串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)動(dòng)物源食品中氯霉素類藥物及其代謝物殘留[J].中國(guó)獸藥雜志.北京：2009，43（3）：42-45.

[2]陳小霞，岳振峰，吉彩霞.高效液相色譜-電噴霧電離三級(jí)四級(jí)桿質(zhì)譜測(cè)定雞肉中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的殘留量[J].色譜，2005，（1）：92-95.

[3]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》[S].2002.