北極海洋沉積物中可培養(yǎng)細菌及其多樣性分析

王楨，李陽，車帥，林學政*

（1.國家海洋局第一海洋研究所國家海洋局海洋生物活性物質(zhì)重點實驗室，山東青島 266061）

北極海洋沉積物中可培養(yǎng)細菌及其多樣性分析

王楨1，李陽1，車帥1，林學政1*

（1.國家海洋局第一海洋研究所國家海洋局海洋生物活性物質(zhì)重點實驗室，山東青島 266061）

利用Zobell 2216E培養(yǎng)基和涂布平板法對北極海洋沉積物中可培養(yǎng)細菌進行分離純化，并利用16S rRNA基因進行分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析。根據(jù)菌落形態(tài)學特征，從59個站點的沉積物樣品中共分離純化獲得570株細菌；基于16S r RNA基因的分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析表明，分離到的可培養(yǎng)細菌分別屬于細菌域的4個門，5個綱，12個目，23個科，47個屬，102個種，其中γ-Proteobactria占絕大多數(shù)；有14株菌株與模式菌株的16S r RNA基因序列相似性小于97%，為6個潛在的新種。北極海域的海洋沉積物中存在著豐富的微生物種質(zhì)資源，為開發(fā)新型生物活性物質(zhì)和特殊功能基因打下了基礎(chǔ)。

北極；海洋沉積物；細菌多樣性；系統(tǒng)發(fā)育分析

1 引言

極地具有獨特的地理、環(huán)境及氣候特征，其主要特點是變化極大的光照輻射、季節(jié)性的光照時間、常年極低的水溫（通常在－1.8～2.0℃）和高鹽度環(huán)境（海水中的鹽度一般為34～35，海冰中鹽囊和鹽通道的鹽度可達普通海水的5倍），形成了一個酷寒、強輻射和高鹽度的自然環(huán)境［1］。北極地區(qū)蘊含著豐富的微生物種質(zhì)資源，由于其特殊的地理位置和氣候條件，生存于其中的微生物大多有其特殊的生理生化特性和代謝特征。由于數(shù)萬年的沉積作用，深海沉積物成分繁復，是非常復雜的微生物棲息地。有機質(zhì)是微生物易利用的物質(zhì)和能源，而深海沉積物中有機質(zhì)含量比海水中的要多104～105倍；同時，深海沉積物也是巨大的基因遺傳變異庫［2］。因此，本研究對于北極地區(qū)深海沉積物中微生物的種質(zhì)及其多樣性研究具有重要的意義。

北極區(qū)域的微生物多樣性研究主要集中在海水－海冰生態(tài)系統(tǒng)中；此外，北極海水中的浮游微生物［3］和冰川中的微生物多樣性研究也有報道［4］，而對北極區(qū)域海底沉積物中微生物的研究則較少，并且集中在某些特定代謝類型，例如硫酸鹽還原菌等［5—6］。對北極環(huán)境中的微生物進行大范圍的分離培養(yǎng)，并在此基礎(chǔ)上進行其微生物多樣性分析僅在北極海冰樣品中得到了開展［7］。

相對于北極的廣闊水域和特殊氣候條件，已有研究結(jié)果并不能全面反映北極海域中的微生物種質(zhì)資源多樣性，因此還需進一步研究調(diào)查。2012年7—9月中國第五次北極科學考察對北極海域海洋沉積物進行了大面積調(diào)查并采集了樣品，本文通過原位涂布培養(yǎng)、分離純化及分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析，分離培養(yǎng)并發(fā)現(xiàn)了大量新的細菌種質(zhì)資源。這些資源對于了解北極海域海洋沉積物微生物的多樣性、發(fā)現(xiàn)新的微生物種質(zhì)資源、開發(fā)利用其特殊的功能基因和生物活性物質(zhì)具有重要意義。

2 材料和方法

2.1 樣品

北極海域海洋沉積物樣品為2012年7—9月中國第五次北極科學考察采集，對箱式采樣器和重力采樣器采取的海洋沉積物樣品，用無菌藥匙采集后置于無菌封口袋中，于“雪龍”船現(xiàn)場進行可培養(yǎng)細菌的分離純化并于4℃保存，回實驗室后進行進一步的分離純化培養(yǎng)與鑒定。

北極海域海洋沉積物采集樣品主要采自于4個區(qū)域：白令海及其鄰近海域、北冰洋海域太平洋扇區(qū)、北冰洋－大西洋扇及其他海域。白令海及其鄰近海域采樣區(qū)域為白令海和阿留申群島周邊海域在內(nèi)的北太平洋北極邊緣海，包括沿白令海西側(cè)航線、阿姆奇卡特島－努尼瓦克島之間的斷面BL，沿白令海峽南部的斷面BS，在圣勞倫斯島和普羅維杰尼亞之間的3個站點及圣勞倫斯島以東、以南的6個站點構(gòu)成的斷面BM，以及白令海峽以南的BN斷面。在本區(qū)域內(nèi)，共對21個站位進行采樣，水深從26.2～3 900 m不等，均為表層沉積物樣品；除BL04站位采用重力采樣器，其他20個站位均采用箱式采樣器。北冰洋海域太平洋扇區(qū)采樣區(qū)域為太平洋扇區(qū)的白令海峽附近及其以北的楚科奇海，包括R、C、CC和SR共4個斷面。在本區(qū)域內(nèi)，共對19個站位進行采樣，水深從26.2～109.5 m不等，均為表層沉積物樣品；均采用箱式采樣器。北極海域大西洋扇區(qū)主要包括AT和BB兩個斷面。在本區(qū)域內(nèi)，共對8個站位進行采樣，水深從2 433.6～3 674.3 m不等，均為底層沉積物樣品；BB04站位采用多管采樣器，其余7個站位采用重力采樣器。其他海域主要是對冰島外海及冰站等11個站位進行采樣，水深從491～1 597.4 m不等。

2.2 分離培養(yǎng)基與可培養(yǎng)細菌的分離純化

海水Zobell 2216E培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，瓊脂粉15 g，過濾原位海水：自來水（體積比為2∶1），1 000 m L。

無菌藥匙取適量泥樣，接于含5 m L無菌海水的試管中，充分混勻，經(jīng)適當系列稀釋后，取50μL涂布于2216E培養(yǎng)基平板上，于4℃低溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)15 d。根據(jù)菌落形態(tài)學特征，挑取不同的單菌落進行進一步的分離純化。

2.3 分子鑒定與與系統(tǒng)發(fā)育分析

DNA模板的制備參照文獻［8］進行。

16S r RNA擴增采用50μL擴增體系（1μL 27 F，1μL 1492 R，25μL Master Mix，23μL dd H2O）反應條件：95℃，5 min；95℃，1 min，55℃，30 s，72℃，1.5 min，30個循環(huán)；72℃延伸7 min。采用細菌16S rRNA擴增通用引物27 F（5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′）和1492R（5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′）進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物股份有限公司進行純化和測序。測序獲得的16S r RNA基因序列長度為1 300～1 400 bp，測序結(jié)果在NCBI進行BLAST分析。序列比對采用BioEdit的多序列比對排列（Clustalw multiple alignment），系統(tǒng)發(fā)育分析采用Mega 4.0的鄰接法（Neighbor-joining method）。與模式菌株的16S rRNA基因相似性比較利用EzTaxon-e Database進行（http：／／eztaxon-e.ezbiocloud.net）［9］。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株的分離純化與鑒定

經(jīng)海水Zobell 2216E培養(yǎng)基平板4℃培養(yǎng)15 d，根據(jù)菌落形態(tài)學特征從59個站位的北極海洋沉積物樣品中共分離并獲得16S rRNA基因有效序列的細菌達570株。利用EzTaxon-e Database（http：／／eztaxon-e.ezbiocloud.net）檢索與獲得的16S r RNA基因序列相似性最高的模式菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)與數(shù)據(jù)庫中已有的模式菌株16S r RNA基因序列相似性達97%的可占98%，其中99%以上的可達74.6%。分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析表明，分離到的可培養(yǎng)細菌分別屬于4個門，分別為變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、厚壁菌門Firmicutes和擬桿菌門Bacteroidetes，5個綱；其中γ-變形菌綱γ-Proteobacteria有409株，數(shù)量最多，占總分離株數(shù)的72%；其次為黃桿菌綱Flavobacteria，共66株，占總分離株數(shù)的12%；屬于α-變形菌綱。α-Proteobacteria、放線菌綱Actinobacteria_c和芽孢桿菌綱Bacilli的菌株數(shù)分別為45株、23株和13株，分別占總分離株數(shù)的8%、4%和2%（見圖1）。值得指出的是，有14株菌株與已有模式菌株的16S r RNA基因序列相似性小于97%，可能為潛在的新種。

圖1 北極海洋沉積物可培養(yǎng)細菌的組成分析Fig.1 Composition analysis of culturable bacteria isolated from Arctic marine sediment

北極海洋沉積物可培養(yǎng)細菌的種屬、菌株數(shù)量以及分離到該菌株的站位數(shù)等基本情況見表1?？梢钥闯?，從59個站位中的北極海洋沉積物樣品中分離得到的570株細菌，分屬于47個屬，102個種；其中γ-變形菌綱γ-Proteobacteria在細菌屬水平上的多樣性最為豐富，包括17個不同的屬，黃桿菌綱Flavobacteria次之，包括11個屬，α-變形菌綱α-Proteobacteria含有7個屬，放線菌綱Actinobacteria_c和芽孢桿菌綱Bacilli各含6個屬。在菌株數(shù)量上，以希瓦氏菌屬Shewanella所含數(shù)量最多，共有153株，分屬于8個種，占總分離菌株數(shù)的27%；且其分布也較廣，共從42個站位的沉積物樣品中分離到該屬的菌株。其次為假交替單胞菌屬Pseudoalteromonas的菌株，共有70株，分屬于10個種，占總菌株數(shù)的12%；其分布也較廣，從23個站位的沉積物樣品中分離到該屬菌株。亞硫酸鹽桿菌屬Sulfitobacter和科爾韋爾氏菌屬Colwellia菌株的出現(xiàn)頻率及多樣性也比較高，分別包括5個種36株和5個種25株。另外，盡管有的屬內(nèi)菌株數(shù)量不多，如鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、副球菌屬Paracoccus等僅含一株菌，但可反映出該海域沉積物中微生物的多樣性。

表1 北極海洋沉積物可培養(yǎng)細菌的分離鑒定情況一覽表Tab.1 Schedule of bacterial isolation and identification from Arctic marine sediment

續(xù)表1

一般認為，16S r RNA基因序列同源性小于97%，可以認為屬于不同的種；同源性小于93%～95%，可以認為屬于不同的屬［10］。經(jīng)測序與對比分析，本文發(fā)現(xiàn)有14個菌株序列與相似性最高的模式菌株的16S r RNA基因序列相似性小于97%，并對這14株菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析（圖2）發(fā)現(xiàn)，可能有6株菌為潛在新種。其中有部分菌株，如菌株731與相似性最高的模式菌株Amphritea japonica JAMM 1866T的16S rRNA基因序列相似性僅有91.67%，可能為新屬（表2）。

表2 疑似新種16S r DNA序列相似性比較結(jié)果Tab.2 Similarity comparison of the 16S rDNA sequences of potential novel species

圖2 北極海洋沉積物中可培養(yǎng)細菌中疑似新種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbor-Joining tree showing the phylogenetic relationships of potential novel species sequences obtained from culturable bacteria isolated from Arctic marine sediment

3.2 可培養(yǎng)細菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，所有可培養(yǎng)菌聚類于5個大的類群，102個種（見圖3和圖4），其中，γ-Proteobacteria綱含有59個種，占據(jù)了細菌多樣性的主要地位，達到了58%（59／102）；其次是Flavobacteria綱細菌，達到了18%（18／102）；11個序列為α-proteobacteria，占11%；8個序列為Bacilli，占8%；6個序列為Actinobacteria_c，占6%。許多可能的新種（16S rRNA序列相似性小于97%）分散于進化樹的多個不同分枝，反映了北極菌種資源的豐富性和新穎性。

圖3 北極海洋沉積物中可培養(yǎng)細菌中變形菌門的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighbor-Joining tree showing the phylogenetic relationships of proteobacteria sequences obtained from culturable bacteria isolated from Arctic marine sediment

在γ-Proteobacteria綱中發(fā)現(xiàn)多個疑似新種，如菌株435和441菌株與相似性最高的模式菌Colwellia asteriadis KMD 002T的16S rRNA相似性僅約有95.95%和95.96%；菌株729、730和731與相似性最高的模式菌Amphritea japonica JAMM 1866T16S rRNA相似性只有91.94%，91.86%和91.67%；菌株5與相似性的模式菌Thalassomonas haliotis A5K－61T的16S r RNA相似性只有96.13%。

圖4 北極海洋沉積物中可培養(yǎng)細菌中黃桿菌綱、放線菌綱、芽孢桿菌綱的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Neighbor-Joining tree showing the phylogenetic relationships of Flavobacteria sequences，Actinobacteria_c sequences and Bacilli sequences obtained from culturable bacteria isolated from Arctic marine sediment

Flavobacteria綱中也含有疑似新種，菌株222、224和535與最近的模式菌Winogradskyella ulvae KMM 6390T相似性只有96.84%、96.88%和96.87%。菌株649、652、659和659－2與最近的模式菌Bizionia echini KMM 6177T相似性只有95.96%、95.71%、95.75%和95.85%，菌株124與最近的模式菌Olleya aquimaris L－4T相似性只有96.67%。

4 討論

為獲得北極海域海洋沉積物中新的細菌種質(zhì)資源，了解其多樣性特征，本研究對來自北極海域的59個站位的海洋沉積物樣品中的可培養(yǎng)細菌進行了分離純化，獲得了大量新的極地微生物種質(zhì)資源。在測定的570株細菌中，變形菌門Proteobacteria占可培養(yǎng)細菌的絕大多數(shù)，其中以γ-Proteobacteria的可培養(yǎng)細菌數(shù)量最多，占總分離菌株數(shù)的75%，多樣性也最為豐富，占細菌種類多樣性的58%。這與國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果相一致，如林曦等［11］發(fā)現(xiàn)北極白令海深海沉積物中微生物的主要類群為γ-Proteobacteria，在γ-變形菌中主要的菌屬為假交替單胞菌屬Pseudoalteromonas，假單胞菌屬Pseudomonas和希瓦氏菌屬Shewanella。Srinivas等［12］對北極孔斯峽灣和斯瓦爾巴特群島的苔原地區(qū)的海底沉積物中可培養(yǎng)細菌的多樣性進行了研究，結(jié)果顯示該區(qū)細菌分屬于四大類，其中γ-Proteobacteria是該區(qū)的優(yōu)勢種。而Groudieva等［13］在對北極海冰可培養(yǎng)微生物多樣性的研究中，也發(fā)現(xiàn)γ-Proteobacteria綱的細菌數(shù)量最多，可占總分離菌數(shù)的70%。

本研究獲得的γ-Proteobacteria細菌中，屬于希瓦氏菌屬的細菌最多，其次為假交替單胞菌屬，假單胞菌屬的數(shù)量也較為豐富。假單胞菌自然界分布極廣，在自然界物質(zhì)轉(zhuǎn)化中作用廣泛且重要，能利用多種有機物，包括一些較復雜的不易被其他微生物利用的有機物［14］；近來在南極土壤乃至深海沉積物中也有發(fā)現(xiàn)，并且與多環(huán)芳烴降解有關(guān)，或直接參與了降解過程［15—16］。希瓦氏菌屬是典型的深海細菌類群之一，該菌屬中絕大多數(shù)為嗜冷或耐冷的細菌［17］。本次實驗還分離到芽孢桿菌綱Bacillus的細菌，該細菌一般為好氧異養(yǎng)細菌，它們的出現(xiàn)表明該環(huán)境中有機質(zhì)比較豐富［18］。

近年來對環(huán)境樣品中的微生物調(diào)查研究大多采用分子生物學技術(shù)，這種方法能夠獲取較為全面的微生物信息，而傳統(tǒng)的人工培養(yǎng)方法因為受到培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等限制而較少應用。但是培養(yǎng)獲得的微生物往往是環(huán)境微生物群落中能夠反映生態(tài)環(huán)境特征的類群，可以更好地了解樣品中處于活體狀態(tài)的優(yōu)勢細菌類群，評估微生物與環(huán)境的關(guān)系［19］；同時對培養(yǎng)獲得的細菌進行生理生化及酶學研究等，可以為開發(fā)利用微生物資源打下基礎(chǔ)［20］。

放線菌與人類關(guān)系密切，目前廣泛應用的抗生素約70%是各種放線菌所產(chǎn)生。一些特殊的放線菌還能產(chǎn)生各種酶制劑、維生素和有機酸等。本實驗分離獲得45株放線菌綱菌株，占總分離菌株的4%。經(jīng)過多年的研究，陸地放線菌的研究已經(jīng)相當深入，現(xiàn)今逐漸轉(zhuǎn)向了海洋放線菌的開發(fā)利用。北極地區(qū)地理位置、氣候條件等的特異性，可能使得處于其中的放線茵也具有特殊的生理生化特性，因此對于北極地區(qū)放線菌次級代謝產(chǎn)物的研究具有重大的理論意義和應用價值。

北極獨特的生態(tài)環(huán)境蘊藏著豐富的細菌種質(zhì)資源。本研究通過優(yōu)化培養(yǎng)基、改變培養(yǎng)條件將獲得更多的可培養(yǎng)菌；而通過分子生態(tài)分析將對原位微生物多樣性獲得更全面的了解。北極沉積物中細菌具有極好的多樣性和豐富性。本文所獲結(jié)果將有助于人們深入認識和開發(fā)這一特殊海域的微生物資源。

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Diversity analysis of culturable bacteria isolated from marine sediments of Arctic

Wang Zhen1，Li Yang1，Che Shuai1，Lin Xuezheng1

（1.Key Lab of Marine Bioactive Substances State Oceanic Administration，F(xiàn)irst Institute of Oceanography，State Oceanic Administration，Qingdao 266061，China）

Culturable bacteria were isolated by use of marine Zobell 2216E medium and spread plate method.Molecular identification and phylogenetic analysis were carried out on the basis of 16S r RNA gene.According to the distinct morphological character of bacterial colony on the marine Zobell 2216E medium plate，a total of 570 isolates were obtained from Arctic sediments.Molecular identification and phylogenetic analysis showed that these isolates belonged to four phylum of the bacteria domain，5 classes，47 genera，and 102 species in total.14 isolates had 16S rRNA gene similarity less than 97%with the closest type strain were grouped into 6 clusters.It indicated that these isolates might be potential novel species.A high diversity of culturable bacteria were isolated from marine sediment of Arctic in term of both species number and phylogenetic composition，which deserves further study and exploitation，such as novel bioactive substances and functional genes.

Arctic；marine sediment；bacterial diversity；phylogenetic analysis

P722.1；P727；Q939.1

A

0253-4193（2014）10-0116-08

2014-03-16；

2014-04-08。

南北極環(huán)境綜合考察與評估專項（CHINARE2012－03－05，CHINARE2013－03－05）。

王楨（1989—），山東省煙臺市人，主要從事極地微生物學研究。E-mail：916376659＠qq.com

*通信作者：林學政，研究員，主要從事海洋微生物及其應用學研究。E-mail：linxz＠fio.org.cn

王楨，李陽，車帥，等.北極海洋沉積物中可培養(yǎng)細菌及其多樣性分析［J］.海洋學報，2014，36（10）：116—123，

10.3969／j.issn.0253-4193.2014.10.012

Wang Zhen，Li Yang，Che Shuai，et al.Diversity analysis of culturable bacteria isolated from marine sediments of Arctic［J］.Acta Oceanologica Sinica（in Chinese），2014，36（10）：116—123，doi：10.3969／j.issn.0253-4193.2014.10.012