埃他卡林對內(nèi)皮素?1誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOSmRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

梅宏波 左祥榮 嚴(yán)星

埃他卡林對內(nèi)皮素?1誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOSmRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

梅宏波 左祥榮 嚴(yán)星

目的研究新型ATP敏感性鉀通道（KATP）開放劑埃他卡林（IPT）對內(nèi)皮素?1（ET?1）誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞（HPAECs）內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。方法原代培養(yǎng)HPAECs，對照組不予干預(yù)，實(shí)驗(yàn)組分別加入ET?1，ET?1＋I(xiàn)PT、KATP開放劑吡那地爾（PIN）或KATP阻斷劑格列本脲（GLI）等孵育。用RT?PCR技術(shù)，分析各組eNOSmRNA表達(dá)；采用Western?blot技術(shù)，分析各組eNOS蛋白表達(dá)。結(jié)果ET?1使HPAECs eNOSmRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)。IPT呈濃度依賴性抑制ET?1的作用。GLI逆轉(zhuǎn)IPT的作用。結(jié)論長期低氧導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，一氧化氮（NO）生成減少、eNOSmRNA和蛋白水平表達(dá)下降，而IPT可改善內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，增加eNOS的表達(dá)和NO的釋放，從而降低肺動脈壓力，可能成為較有前途的治療肺動脈高壓（PAH）的新型化合物。

埃他卡林；內(nèi)皮素?1；KATP通道；人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞

低氧性肺動脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是指正常人移居高原后，由于缺氧，引起肺小動脈功能及器質(zhì)性改變，從而導(dǎo)致肺動脈壓力增高的病癥［1］。

研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的一氧化氮（NO）在HPH的發(fā)生機(jī)制中起重要調(diào)節(jié)作用。NO是一種氣體分子，通過舒張血管、抑制血小板聚集和白細(xì)胞黏附、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、抑制內(nèi)皮素?1（ET?1）分泌、清除氧自由基等多種途徑抗肺動脈高壓（PAH）。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）是NO合成中重要的限速酶，通常將NOS分為3型：內(nèi)皮型（eNOS或NOS3）、神經(jīng)型（nNOS或NOS1）和誘生型（iNOS或NOS2）［2?3］。長期低氧可導(dǎo)致eNOS基因和蛋白的表達(dá)水平下調(diào)。王慧等［3］研究發(fā)現(xiàn)具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的新型KATP開放劑埃他卡林（iptakalim，IPT）可拮抗長期低氧誘導(dǎo)的大鼠肺組織eNOSmRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)。

本研究應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄?聚合酶鏈反應(yīng)（RT?PCR）和Western?blot技術(shù)，進(jìn)一步了解IPT對ET?1誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞（HPAECs）eNOSmRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 ET?1（Sigma公司）和IPT（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥理和毒理研究所研制合成）生理鹽水配制；格列本脲（glibenclamide，GLI，Sigma公司，美國）生理鹽水配制后再用氫氧化鈉10μmol／L滴定pH值為8.5；吡那地爾（pinacidil，PIN，Sigma公司），二甲基亞砜和生理鹽水按1∶3配制；胎牛血清（FBS）（GIBCO公司），M199（GIBCO公司），內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（Sigma公司），RNA Trizol試劑（Invitrogen公司）；DEPC（Sigma公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TakaRa公司）；2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker（北京天根生化科技有限公司）；Rotor?Gene 3000 PCR儀（Corbett Research，Syd?ney，Australia）；eNOS一抗為多克隆兔抗人抗體（Bio?world Technology Inc），二抗為辣根酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H＋L）多克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），內(nèi)參為HRP標(biāo)記的單克隆鼠抗人GAP?DH抗體（上海康成生物公司）。預(yù)染蛋白Marker（New England Biolab公司），ECL發(fā)光液（Cell Signaling Technology）。RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒均為南京碧云天產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 原代培養(yǎng)HPAECs：在無菌條件下取因各種原因行肺葉切除術(shù)的非肺動脈高壓患者肺葉（經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)及患者知情同意），分離肺動脈，立即置入磷酸鹽緩沖液（PBS）（NaCl 138.0 mmol／L，KCl 5.0mmol／L，Na2HPO40.3mmol／L，KH2PO40.3mmol／L，NaHCO34.0 mmol／L，青霉素105 U／L和Streptomycin 100 mg／L）。沖洗干凈去除紅細(xì)胞，無菌鑷翻轉(zhuǎn)肺動脈使內(nèi)膜朝外，0.25%胰蛋白酶消化15 min，收集消化液，離心收集細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液按（2～3）×106個／m l接種于含20%FBS的M199培養(yǎng)液的50 ml培養(yǎng)瓶中，37℃5%CO2孵箱（Thermo Scientific Forma公司）培養(yǎng)，每周換液2次，細(xì)胞貼壁生長，呈多角形，鋪路石樣外觀；待細(xì)胞生長融合＞80%后用0.25%胰蛋白酶消化傳代，傳代后細(xì)胞用含10%FBS的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)，取4～6代為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)處理及分組：將生長良好的HPAECs從培養(yǎng)瓶消化下來，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1.8×108／L，接種到6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞在不含F(xiàn)BS的M199培養(yǎng)液孵育24 h。根據(jù)研究目的進(jìn)行分組。

1.2.2.1 不同濃度IPT對ET?1誘導(dǎo)的eNOSmRNA和蛋白表達(dá)水平的影響：對照組A1組（不予干預(yù)）；B1組：培養(yǎng)液中加入ET?1 10 nmol／L；C1組：培養(yǎng)液中加入ET?1 10 nmol／L＋I(xiàn)PT 0.1μmol／L；D1組：培養(yǎng)液中加入ET?1 10 nmol／L＋I(xiàn)PT 1.0μmol／L；E1組：培養(yǎng)液中加入ET?1 10 nmol／L＋I(xiàn)PT 10μmol／L。B1、C1、D1、E1組分別孵育12 h。

1.2.2.2 GLI對IPT作用的影響：對照組A2組（不予干預(yù)）；B2組：培養(yǎng)液中加入ET?1 10 nmol／L；C2組：培養(yǎng)液中加入ET?1 10 nmol／L＋PIN 10μmol／L；D2組：培養(yǎng)液中加入ET?1 10 nmol／L＋I(xiàn)PT 10μmol／L；E2組：培養(yǎng)液中加入ET?1 10 nmol／L＋PIN 10μmol／L＋GLI10 μmol／L；F組：培養(yǎng)液中加入ET?1 10 nmol／L＋I(xiàn)PT 10 μmol／L＋GLI 10μmol／L。B2、C2、D2、E2、F組分別孵育12 h。

1.2.3 總RNA提取及RT?PCR檢測：用TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，提取的RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR反應(yīng)物按照Taq PCR Master Mix反應(yīng)體系加入。所用引物均由上海細(xì)胞生物所合成，加DEPC水溶解，濃度配置成10μmol／L。eNOS上游：5’?GAGTCCTCACCGCCTTCTC?3’；下游：5’?AGGAAGCGGGTGGCAGTA?3’，擴(kuò)增長度為664 bp。GAPDH上游：5’?CGGAGT?CAACGGATTTGGTCGTAT?3’；下游：5’?AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC?3’，擴(kuò)增長度300 bp。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s、53℃退火60 s、72℃延伸60 s，共32個循環(huán)，最后72℃7min，產(chǎn)物4℃保存。取PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠（含0.5μg／ml溴化乙錠）電泳，紫外燈下觀察，拍照。計(jì)算eNOS與內(nèi)對照GAPDH條帶灰度比值。

1.2.4 細(xì)胞總蛋白提取及Western blot檢測：用RIPA裂解液裂解各組細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA法檢測各組蛋白濃度，制備8%SDS?PAGE，每泳道加總蛋白量80μg，進(jìn)行70 V／120 V恒壓電泳，經(jīng)濕轉(zhuǎn)印跡到二氟化樹脂（PVDF）膜（Amresco公司），5%BSA?TBST洗滌后加5%牛奶（光明牌脫脂奶粉）?BSA?TBST 37℃封閉1 h，分別加入eNOS兔抗人多克隆抗體（1∶1000稀釋）和GAPDH鼠抗人單克隆抗體（1∶5000稀釋），4℃孵育過夜，5%BSA?TBST洗滌后，GAPDH直接通過ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影；eNOS再加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶10 000稀釋），37℃孵育60 min，5%BSA?TBST洗滌，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影。eNOS蛋白相對含量用eNOS／GAPDH灰度比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，各組間差異比較采用方差分析，各實(shí)驗(yàn)組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ET?1對eNOSmRNA和蛋白表達(dá)水平的影響 B1組與A1組，B2組與A2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），10 nmol／LET?1抑制eNOSmRNA和蛋白表達(dá)，使eNOSmRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)。見表1，2。

2.2 不同濃度IPT對ET?1誘導(dǎo)的eNOSmRNA和蛋白表達(dá)水平的影響 C1、D1、E13組eNOSmRNA和蛋白灰度比值均高于B1組（P＜0.05），IPT呈濃度依賴性抑制ET?1誘導(dǎo)的eNOSmRNA和蛋白表達(dá)。D2與C2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明IPT與KATP開放劑PIN作用相同（表2）。在本實(shí)驗(yàn)條件下，IPT 10μmol／L能完全逆轉(zhuǎn)ET?1 10 nmol／L所誘導(dǎo)的eNOSmRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)，使之恢復(fù)至ET?1誘導(dǎo)前的水平。見表1，2。

2.3 GLI對IPT的影響 在本實(shí)驗(yàn)條件下，eNOS mRNA和蛋白灰度比值，E2組與C2組、F組與D2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），E2組、F組與B2組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？梢娞禺愋訩ATP阻斷劑GLI可拮抗IPT和PIN對ET?1誘導(dǎo)的eNOSmRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。見表2。

表1 IPT對ET?I誘導(dǎo)的eNOS mRNA和蛋白表達(dá)的影響（s，n＝3）

注：與A1組比較，?P＜0.05；與B1組比較，△P＜0.05

組別eNOS mRNA蛋白A1組0.412±0.016 0.462±0.017 B1組0.105±0.006?0.085±0.004?C1組0.165±0.010?△0.156±0.008?△D1組0.244±0.012?△0.253±0.012?△E1組0.408±0.018△0.454±0.016△

表2 GLI拮抗IPT對eNOSmkNA和蛋白表達(dá)的影響（s，n＝3）

表2 GLI拮抗IPT對eNOSmkNA和蛋白表達(dá)的影響（s，n＝3）

注：與A2組比較，?P＜0.05；與B2組比較，△P＜0.05

組別eNOS mRNA蛋白A2組0.420±0.016 0.470±0.019 B2組0.114±0.004?0.102±0.002?C2組0.410±0.018△0.480±0.020△D2組0.414±0.014△0.476±0.018△E2組0.106±0.002?0.112±0.003?F組0.110±0.003?0.113±0.004?

3 討論

目前認(rèn)為，在肺動脈血流剪切力、缺氧等因素作用下，肺血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分改變、結(jié)締組織不斷沉積導(dǎo)致肺血管痙攣、異常生長和重構(gòu)，最終形成PAH［4］。

NO具有較強(qiáng)的舒張血管和抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用，內(nèi)源性NO在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)經(jīng)唯一的、關(guān)鍵的限速酶NOS催化L?精氨酸而生成。在哺乳動物，NOS有3種亞型即NOS1、NOS2、NOS3，它們分別是不同基因的產(chǎn)物，且有50%～60%的序列同源性［5］。NOS3又稱eNOS，為鈣依賴性NOS，分子量約為140 kDa，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，通常與膜蛋白相結(jié)合以維持血管活性。長期低氧可抑制eNOS基因和蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致eNOS含量降低，從而使內(nèi)源性NO的合成和釋放減少，促進(jìn)HPH的發(fā)生和發(fā)展［6?8］。另外，動物實(shí)驗(yàn)表明，NO可通過調(diào)節(jié)TIMP?1（基質(zhì)金屬蛋白酶?1）／MMP?1（基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子?1）平衡而減少膠原堆積和增加膠原降解來調(diào)節(jié)高血流所致的肺血管重構(gòu)［9］。

雖然目前對PAH的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但一致認(rèn)為ET系統(tǒng)在PAH的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用［10?11］。ET有4種異構(gòu)體：ET?1、ET?2、ET?3及血管活性腸收縮肽（VIC）［12］。其中ET?1由21個氨基酸殘基組成，是目前已知作用最強(qiáng)、持續(xù)最久的縮血管活性多肽。并且ET?1還能促進(jìn)肺動脈平滑肌細(xì)胞遷移和增殖，導(dǎo)致肺血管重構(gòu)［13?15］。目前ET受體拮抗劑如波生坦已廣泛應(yīng)用于臨床，但其價格昂貴，且對ET受體具有非選擇性，從而限制了其在臨床上的應(yīng)用。

本研究表明ET?1濃度為10 nmol／L時可使eNOS mRNA和蛋白的表達(dá)水平下調(diào)，從而使內(nèi)源性NO的合成和釋放量減少，促進(jìn)HPH的發(fā)生和發(fā)展；新型KATP開放劑IPT呈濃度依賴性地拮抗ET?1 10 nmol／L對原代培養(yǎng)HPAECs eNOSmRNA和蛋白表達(dá)水平的影響，濃度為10μmol／L時最為明顯，并使之恢復(fù)到ET?1 10 nmol／L誘導(dǎo)前的水平，從而可改善內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，增加eNOS的表達(dá)和NO的釋放，逆轉(zhuǎn)HPH；特異性KATP阻斷劑GLI濃度為10μmol／L時可完全逆轉(zhuǎn)10μmol／L IPT的作用。

IPT是我國學(xué)者自行設(shè)計(jì)與合成的脂肪仲胺類KATP開放劑，為一新型KATP開放劑，此前發(fā)現(xiàn)IPT呈濃度依賴性地抑制HPAECs合成分泌ET［11］、抑制ET?1誘導(dǎo)的人肺動脈平滑肌細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2（ERK1／2）磷酸化［16］、抑制ET?1誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖［17］，并且其靶向性較其他KATP開放劑高、不良反應(yīng)少，有可能成為較有前途的治療PAH的新型化合物。

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Effects of ip takalim on them RNA and protein expression level of eNOS in p rimary cultured human pulmonary ar?terial endothelial cells induced by ET?1

MEIHong?bo，YAN Xing．DepartmentofRespitory Medicine，the 82nd Hospital of Chinese PLA，Huaian 223001，China；ZUO Xiang?rong．ICU，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China

ObjectiveTo study the effects of iptakalim，a novel ATP?sensitive potassium channel opener，on the mRNA and protein expression level of eNOS in primary cultured human pulmonary arterial endothelial cells（HPAECs）in?duced by endothelin?1（ET?1）.MethodsBy Western?blot analysis，the protein expression level of eNOSwasmeasured in primary cultured HPAECs.By RT?PCR analysis，themRNA expression level of eNOSwasmeasured in primary cultured HPAECs.The control group received no intervention，and the other groups were incubated with ET?1，ET?1＋iptakalim，pinacidil or glibenclamide.ResultsThe results demonstrated that ET?1 downregulated themRNA and protein expression level of eNOS.Iptakalim inhibited ET?1?induced downregulation of the mRNA and protein expression level of eNOS in a concentration?dependentmanner.Glibenclamide，a selective KATPchannel antagonist，could antagonize the effects of iptakalim.ConclusionsPulmonary vascular endothelial dysfunction is induced by chronic hypoxia，and the level of NO，themRNA and protein expression of eNOS are decreased.Iptakalim can improve the vascular endothelial dysfunction，in?crease the expression of eNOS and the level of NO，decrease pulmonary artery pressure and will be a most promising new compound to treat pulmonary arterial hypertension.

iptakalim；endothelin?1；KATPchannel；human pulmonary arterial endothelial cells

R 917

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2014.07.020

2013?10?30）

223001江蘇省淮安市，中國人民解放軍第八二醫(yī)院呼吸內(nèi)科（梅宏波，嚴(yán)星）；210029江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院ICU（左祥榮）