優(yōu)質(zhì)殼聚糖/殼寡糖的制備工藝及水溶性殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物的合成

楊俊玲，趙福龍，夏 軍，張曉波，王 璇

（天津工業(yè)大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，天津 300387）

優(yōu)質(zhì)殼聚糖/殼寡糖的制備工藝及水溶性殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物的合成

楊俊玲，趙福龍，夏 軍，張曉波，王 璇

（天津工業(yè)大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，天津 300387）

以皮皮蝦殼作基本原料，分別采用稀鹽酸、稀堿溶液浸泡，除去蝦殼中的鈣質(zhì)等無機(jī)質(zhì)和蛋白等有機(jī)成分，以濃堿脫除甲殼素上的乙?；频脷ぞ厶?再以其為原料，采用H2O2氧化降解法得到水溶性殼寡糖.將所制水溶性殼寡糖加入到氯化鐵溶液中，設(shè)定各項(xiàng)條件，使二者進(jìn)行配位反應(yīng).經(jīng)系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)，得出制備高脫乙酰度殼聚糖最適宜條件為：溫度85℃，時(shí)間9 h，NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)45%，料液比1∶300.所得產(chǎn)品脫乙酰度為89.6%，收率（殼聚糖/甲殼素）為73.1%，其他各項(xiàng)指標(biāo)也均為優(yōu)良級(jí).制備水溶性殼寡糖最適宜條件為：溫度65℃，時(shí)間6 h，醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.0%，H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.0%，產(chǎn)品平均粘均分子質(zhì)量為2.9 ku，外觀為淡黃色粉末，溶解性能優(yōu)良.通過對(duì)FT-IR和UV譜圖的分析，證實(shí)了水溶性殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物的生成.

高脫乙酰度殼聚糖；水溶性殼寡糖；水溶性殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物

殼聚糖（chitosan，簡(jiǎn)稱CTS）是地球上最豐富的天然高分子化合物之一，其在很多領(lǐng)域都展現(xiàn)出較高的應(yīng)用前景[1].經(jīng)研究證實(shí)，高脫乙酰度殼聚糖（HD-chitosan）在降解、結(jié)晶、活細(xì)胞和酶的固定化、制作反滲透膜和超濾膜等中具有更優(yōu)的理化性質(zhì)[2].因此，高脫乙酰度殼聚糖更具研究意義和應(yīng)用價(jià)值.但殼聚糖的分子質(zhì)量大，僅溶于少數(shù)酸性體系，這限制了其應(yīng)用前景[3].而其降解產(chǎn)物殼寡糖（COS）的聚合度一般在2～10之間，其水溶性好、易被機(jī)體吸收利用，具有抑菌、抗腫瘤等生物活性，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等領(lǐng)域[4-6]具有廣闊的應(yīng)用前景，日益受到專家學(xué)者以及廠商們的關(guān)注[7].由于殼聚糖良好的生物相容性，對(duì)其化學(xué)改性亦種類繁多[8].其中，與金屬形成配合物是重要一項(xiàng).因其對(duì)過渡金屬具有良好的配位作用，使殼聚糖基金屬配合物材料產(chǎn)生許多優(yōu)良性能[9-11].目前，以殼聚糖金屬鐵配合物的研究居多，而以水溶性殼寡糖為基質(zhì)，絡(luò)合具有功能特性的過渡金屬鐵（Ⅲ）的報(bào)道鮮有見到.為此，本文通過研究殼聚糖/殼寡糖的制備工藝，獲得優(yōu)質(zhì)殼聚糖/殼寡糖產(chǎn)品，然后選用更具活性的水溶性殼寡糖作為基質(zhì)絡(luò)合過渡金屬Fe（Ⅲ），再以FT-IR和UV來表征水溶性殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物的結(jié)構(gòu)特征.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原材料與儀器

原材料：皮皮蝦殼，市售；過氧化氫，天津大沽精細(xì)化工有限公司生產(chǎn)；氫氧化鈉（工業(yè)級(jí)），濟(jì)南永茂化工有限公司生產(chǎn)；鹽酸、醋酸、氫氧化鈉、氯化鐵、鄰菲羅琳等試劑，均為分析純，市售.

儀器：DF-101S-B型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，山東鄄城華魯電熱儀器有限公司生產(chǎn)；紫外分光光度計(jì)（UV），北京瑞利分析儀器有限公司生產(chǎn)；370DTGS型紅外光譜儀，美國Thermo公司生產(chǎn)；FA1004型電子天平，上海瞬宇恒平科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；SHZ-3型循環(huán)水式真空泵，上?？等A生化儀器制造有限公司生產(chǎn)；電熱真空干燥箱，天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司生產(chǎn)；HK-1D型恒溫水浴槽，南京大學(xué)應(yīng)用物理研究所生產(chǎn)；SX2-4-10型箱式電阻爐，山東省龍口市先科儀器有限公司生產(chǎn)；烏氏粘度計(jì)，內(nèi)徑0.5 mm，淄博現(xiàn)代科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn).

1.2 殼聚糖的制備

首先將稱取的皮皮蝦殼清洗干凈，用稀鹽酸浸泡除去鈣質(zhì)等無機(jī)鹽，水洗至中性，加入稀氫氧化鈉（工業(yè)級(jí)）溶液中攪拌脫除蛋白和酯類，然后與濃氫氧化鈉（工業(yè)級(jí)）溶液反應(yīng)脫除乙?；?，過濾水洗至中性后，烘干即得殼聚糖.其間，分別以溫度、時(shí)間、氫氧化鈉濃度、料液比為單因素變量，以殼聚糖產(chǎn)品的脫乙酰度為標(biāo)準(zhǔn)，探討殼聚糖的制備工藝條件.按文獻(xiàn)[12-13]的方法對(duì)殼聚糖脫乙酰度進(jìn)行測(cè)定.

1.3 殼寡糖的制備

準(zhǔn)確稱取所制殼聚糖產(chǎn)品（采取優(yōu)化條件下產(chǎn)品：脫乙酰度為89.6%；粘均分子質(zhì)量為8.8×106），并溶入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙酸中，待完全溶解后，設(shè)定溫度，緩慢加入雙氧水，恒溫?cái)嚢杷≈薪到猓{(diào)節(jié)至中性后蒸餾濃縮，用3倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉，靜置過夜.真空干燥后即得水溶性殼寡糖產(chǎn)品.其間，分別以溫度、雙氧水濃度、醋酸濃度、時(shí)間為單因素變量，以寡糖產(chǎn)品的分子質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)，研究殼寡糖的制備工藝條件.

1.4 殼寡糖相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

精確稱取自制殼寡糖樣品，將其溶入0.1 mol/L的乙酸-0.2 mol/L氯化鈉緩沖溶液中，待樣品溶解后，用烏氏粘度計(jì)于（25±0.01）℃下恒溫測(cè)量樣品粘度，以文獻(xiàn)[14-15]所提方法計(jì)算其相對(duì)分子質(zhì)量.

1.5 殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物的合成

準(zhǔn)確稱取殼寡糖產(chǎn)品（為優(yōu)化條件下所制），將其加入到一定濃度的氯化鐵溶液中，以0.1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至1.8左右，然后置于45℃恒溫水浴鍋中絡(luò)合反應(yīng)6 h.反應(yīng)結(jié)束后，調(diào)節(jié)至中性，有沉淀析出，抽濾，分別以蒸餾水、乙醇-丙酮混合液淋洗.55℃下真空干燥后，即得橙黃色殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物.

1.6 紅外光譜表征

采用KBr壓片法對(duì)殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物進(jìn)行紅外表征.

1.7 紫外吸收光譜表征

以1.0%醋酸為空白試劑，于190～450 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物的紫外吸收光譜.

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖的制備工藝

為研究各因素對(duì)脫乙酰反應(yīng)的影響，分別進(jìn)行了反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、料液比（g∶mL）、NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)4個(gè)單因素條件實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1至圖4所示.

圖1 溫度對(duì)脫乙酰反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of temperature on deacelation reaction

由圖1可知，溫度對(duì)脫乙酰反應(yīng)的影響較大，溫度在60～70℃之間時(shí)，脫乙酰度增加明顯，但其值較低，其應(yīng)用效果有限；當(dāng)溫度增大至85～90℃時(shí)，可看出脫乙酰度顯著增大，其值能達(dá)90%以上.因此，從效能角度考慮，溫度選擇在85℃左右為宜.由圖2可知，增大反應(yīng)時(shí)間有利于提高殼聚糖的脫乙酰度，其影響效應(yīng)比較接近于線性規(guī)律，當(dāng)時(shí)間增加至9 h時(shí)，其脫乙酰度接近80%，足可以展現(xiàn)其應(yīng)用性質(zhì).因此，時(shí)間選擇在9 h為宜.由圖3可知，隨著NaOH濃度的增大，殼聚糖脫乙酰度的增大呈現(xiàn)前緩、中快、后慢的變化趨勢(shì).當(dāng)NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大至45%時(shí)，其脫乙酰度就已在85%以上，NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于45%時(shí)，其影響效果逐漸變小.由圖4可知，料液比對(duì)脫乙酰反應(yīng)的影響基本類似于NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，同樣呈現(xiàn)出前緩、中快、后慢的增大趨勢(shì).當(dāng)料液比達(dá)到1∶300時(shí)，殼聚糖的脫乙酰度就已增大至80%以上，隨著料液比的繼續(xù)增大，脫乙酰度的增大并不顯著.因此，對(duì)以上2個(gè)因素下的成本、效果等角度綜合分析，可得出：NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)選在45%為宜，料液比選在1∶300為宜.從皮皮蝦殼至各階段產(chǎn)品的收率如表1所示.

圖2 時(shí)間對(duì)脫乙酰反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of time on deacelation reaction

圖3 NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)脫乙酰反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of mass fraction of Sodium hydroxide on deacelation reaction

圖4 料液比對(duì)脫乙酰反應(yīng)的影響Fig.4 Eeffect of ratio of material to solvent on deacelation reaction

表1 從皮皮蝦殼至各階段產(chǎn)品的收率Tab.1 Yield of products from mantisshrimp shell to each stage

為驗(yàn)證上述反應(yīng)條件的適宜性，進(jìn)行了3次脫乙酰反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示.

表2 優(yōu)化條件下所制殼聚糖的質(zhì)量指標(biāo)分析Tab.2 Quality analysis of chitosan prepared under optimized conditions

從表2中看出，3次實(shí)驗(yàn)所得殼聚糖產(chǎn)品的脫乙酰度平均值為89.6%，收率（殼聚糖/甲殼素）平均值為73.1%，其他各項(xiàng)指標(biāo)也均為優(yōu)良級(jí).故可將制備優(yōu)質(zhì)高脫乙酰度殼聚糖的最適宜條件定為：溫度85℃，時(shí)間9 h，NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)45%，料液比1∶300.

2.2 水溶性殼寡糖的制備工藝

為研究各因素對(duì)H2O2降解反應(yīng)的影響，分別進(jìn)行了反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)4個(gè)單因素條件實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5至圖8所示.

圖5 溫度對(duì)降解反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of temperature on degradation reaction

由圖5可見，溫度對(duì)降解反應(yīng)的影響很顯著，當(dāng)溫度為40～65℃時(shí)，粘均分子質(zhì)量呈現(xiàn)快速減小趨勢(shì)，之后趨勢(shì)變得緩和，可得出溫度是影響降解程度的主要因素之一.結(jié)合表3分析，溫度變大，雖有利于增大降解程度，但產(chǎn)品顏色加深（可能其他副反應(yīng)增多），不利于得到優(yōu)質(zhì)降解產(chǎn)品，故溫度不宜過高；由圖6可見，隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，降解產(chǎn)品的相對(duì)分子質(zhì)量呈現(xiàn)均勻下降趨勢(shì)，至6 h時(shí)，該趨勢(shì)變得緩和，即再增大降解時(shí)間，其影響效果亦有限.由圖7可見，醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)降解反應(yīng)的影響不大，隨著醋酸濃度的增大，產(chǎn)品的分子質(zhì)量先減小后增大，當(dāng)醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)至4.0%時(shí)，達(dá)到最低.由圖8可見，隨著雙氧水質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，降解產(chǎn)品的相對(duì)分子質(zhì)量先快速減小后緩慢增大，質(zhì)量分?jǐn)?shù)至4.0%時(shí)達(dá)到最低值，說明雙氧水濃度并非越大越有利于氧化降解.從產(chǎn)品成本、成色品質(zhì)、效能等角度考慮，再結(jié)合以上分析結(jié)果，得出制備水溶性殼寡糖的H2O2氧化降解的適宜條件：溫度65℃，時(shí)間6 h，醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.0%，H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.0%.

圖6 時(shí)間對(duì)降解反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of time on degradation reaction

圖7 乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)降解的影響Fig.7 Effect of mass fraction of acetic acid on degradation reaction

圖8 雙氧水質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)降解的影響Fig.8 Effect of mass fraction of hydrogen peroxide on degradation reaction

表3 不同溫度下制備的殼寡糖成色分析Tab.3 Fineness determination of chitooligosaccharide prepared at different temperatures

為驗(yàn)證上述反應(yīng)條件的適宜性，進(jìn)行了3次H2O2降解實(shí)驗(yàn).結(jié)果為：產(chǎn)品的相對(duì)分子質(zhì)量平均值為2.9 ku，外觀品質(zhì)為淡黃色粉末，其溶解性能見表4.可看出：降解產(chǎn)品具有良好的溶解性能.驗(yàn)證結(jié)果證明，可將溫度65℃，時(shí)間6 h，醋酸4.0%，H2O24.0%定為H2O2氧化降解殼聚糖的最適宜條件.

表4 優(yōu)化條件下所制殼寡糖在不同溶劑中的溶解性能檢驗(yàn)Tab.4 Solubility property of chitooligosaccharide prepared under optimized conditions with different solvent systems

2.3 殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物的紅外分析

圖9所示為殼寡糖與殼寡糖Fe3+配合物的紅外譜圖.

從圖9中對(duì)比可知：位于3 440 cm-1處氨基和羥基的N-H、O-H伸縮振動(dòng)峰紅移至3 412 cm-1處且峰形變得尖銳，說明了-NH2、-OH可能參與了與Fe3+的配位反應(yīng)，位于1 634 cm-1處的N-H伸縮振動(dòng)峰移至1 637 cm-1處，位于1 600 cm-1處的-NH2變形振動(dòng)峰移至1 617 cm-1處，這進(jìn)一步說明了-NH2與Fe3+發(fā)生了配位；位于1 155 cm-1處的仲羥基C-O伸縮振動(dòng)峰與1 091 cm-1處的伯羥基C-O伸縮振動(dòng)峰分別移至1 212 cm-1、1 133 cm-1處，同樣表征了-OH參與了配位.

2.4 殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物的紫外分析

圖10為殼寡糖與殼寡糖Fe3+配合物的紫外譜圖.

由圖10可見，殼寡糖在波長(zhǎng)范圍內(nèi)幾乎沒有吸收，而其Fe（Ⅲ）配合物在230 nm處有最大吸收峰，而且其峰形寬而強(qiáng)，其原因可能是配合物中的N、O孤對(duì)電子產(chǎn)生了n→σ*躍遷，致使光譜發(fā)生變化.由此可知，F(xiàn)e3+確實(shí)與殼寡糖產(chǎn)生了配位反應(yīng).

圖9 殼寡糖與殼寡糖Fe3+配合物的紅外譜圖Fig.9 FT-IR spectrum of oligosaccharide and oligosaccharide-Fe3+complex

圖10 殼寡糖與殼寡糖Fe3+配合物的紫外譜圖Fig.10 UV spectrum of oligosaccharide and oligosaccharide-Fe3+complex

3 結(jié)論

（1）通過對(duì)高脫乙酰度殼聚糖和水溶性殼寡糖的工藝條件研究，優(yōu)化了二者的制備工藝，得出前者最適宜條件為：溫度85℃，時(shí)間9 h，NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)45%，料液比1∶300.此條件下所得產(chǎn)品脫乙酰度為89.6%，收率（殼聚糖/甲殼素）為73.1%，其他各項(xiàng)指標(biāo)也均為優(yōu)良級(jí).后者最適宜條件：溫度65℃，時(shí)間6 h，醋酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.0%，H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.0%，產(chǎn)品平均粘均分子量為2.9 ku，外觀為淡黃色粉末，溶解性能優(yōu)良.

（2）對(duì)配合物的FT-IR和UV譜圖分析表明：殼寡糖分子鏈上的-NH2與-OH確實(shí)與Fe3+發(fā)生了配位，證實(shí)了水溶性殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物的生成.

（3）本文系統(tǒng)全面地介紹了優(yōu)質(zhì)殼聚糖與水溶性殼寡糖的制備工藝.同時(shí)，對(duì)水溶性殼寡糖與Fe（Ⅲ）的配位性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，合成了水溶性殼寡糖Fe（Ⅲ）配合物.可將本文作為高分子材料和金屬有機(jī)材料研究的有效參考.

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Preparation process of quality CTS/soluble COS and synthesis of soluble COS-Fe（Ⅲ）complex

YANG Jun-ling，ZHAO Fu-long，XIA Jun，ZHANG Xiao-bo，WANG Xuan
（School of Environmental and Chemical Engineering，Tianjin Polytechnic University，Tianjin 300387，China）

HD-chitosan was produced with basic material-mantis shrimp shell which was removed inorganic salt with chlorhydric acid,proteins with dilute alkali solution,then dislodged acetyl group with concentrated alkaline solution.Next,the above-mentioned HD-chitosan was degraded with H2O2for producing soluble COS.With adjusted conditions,the soluble COS was added to ferric chloride solution for complexing.It was confirmed by series of experiments that the optimized conditions of preparing HD-chitosan was 45%NaOH,the ratio of material to solvent(g/ml）1∶300,and at constant temperature 85℃for 9 h.The yield of HD-chitosan to chitin was 73.1% with other excellent quality index.The optimized conditions of preparing soluble oligosaccharide was 4.0%acetic acid,4.0%H2O2and at constant temperature 65℃for 6 h.The viscosity average molecular weigh of products was 2.9 ku.In addition,it was also observed that the products of oligosaccharide was desirable faint yellow powder and had fine solubility.According to analysis of FT-IR and UV spectrum,the formation of soluble COS-Fe(Ⅲ）complex was certified.

HD-chitosan；soluble COS；soluble COS-Fe（Ⅲ）complex

TQ314.1

A

1671-024X（2014）05-0039-05

2014-05-20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21101113）

楊俊玲（1957—），女，教授，碩士生導(dǎo)師.E-mail：yangjunling@tjpu.edu.cn