丙型肝炎病毒抗體雙抗原夾心法的應(yīng)用研究

時(shí)慧挺

丙型肝炎病毒(HCV)為通過血液或者是血液制品進(jìn)行傳播的一種病毒, 在輸血過程中丙型肝炎病毒傳染為一個(gè)無法忽視的途徑, 已經(jīng)受到了廣大醫(yī)學(xué)工作者和患者的重視。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示HCV感染的發(fā)生率較高, 分布較廣, 出于對(duì)輸血引起HCV傳播進(jìn)行控制的目的, 臨床需對(duì)獻(xiàn)血者展開抗-HCV檢測(cè)［1］。本次研究中出于對(duì)丙型肝炎病毒抗體雙抗原夾心法的臨床應(yīng)用效果進(jìn)行分析探討的目的, 對(duì)230份陰性血液標(biāo)本和230份質(zhì)控血液標(biāo)本展開了相關(guān)檢測(cè), 并對(duì)其檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析, 現(xiàn)匯報(bào)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標(biāo)本來源于2012年1月～2013年12月間本院血液篩查陰性標(biāo)本, 抽取其中的230份作為研究對(duì)象,另收集230份質(zhì)控標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 研究方法 對(duì)以上統(tǒng)計(jì)460份血液標(biāo)本展開相關(guān)檢測(cè), 采取雙抗原夾心法對(duì)丙型病毒肝炎抗體進(jìn)行檢測(cè), 并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 檢測(cè)方法 所需試劑包括：吉比愛、Ortho 丙肝病毒抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑, 除此外還需要ChironRIBA 確認(rèn)試劑。

抗原制備：嵌合表位抗原經(jīng)包涵體的形式表達(dá), 利用離子交換層析方式展開純化, 而后經(jīng) Sephadex G-50 柱凝膠過濾收集, 經(jīng)SDS-PAGE對(duì)抗原蛋白展開鑒定。

雙抗原夾心法：采取濃度為50 mmol/L的碳酸鹽緩沖液對(duì)抗原進(jìn)行稀釋, 多肽抗原工作濃度為：結(jié)構(gòu)區(qū)多肽15 lg/ml, NS4區(qū)多肽0.5 lg/ml, NS5區(qū)多肽0.25 lg/ml, 基因工程表達(dá)抗原工作濃度C7為1 g/ml, C11為1 g/ml。在每個(gè)孔中加入100 μl, 37℃條件下放置1 h, 而后在4℃冰箱中過夜保存,經(jīng)濃度為30%的小牛血清PBST進(jìn)行封閉, 每孔加入200 μl,在37℃條件下放置1 h, 將封閉液棄去, 取50 μl樣品稀釋液,每孔加5 μl, 37℃條件下放置30 min, 而后經(jīng)PBST沖洗5次。取最適合的酶稀釋度, 經(jīng)棋盤滴定法每孔加入50 μl工作濃度的酶標(biāo)記抗原, 37℃條件下放置15 min, 經(jīng)PBST沖洗5次,每孔加入50 μl底物緩沖液和50 μl顯色劑, 37℃條件下放置10 min, 充分顯色。而后每孔加入50 μl濃度為2 mol/L的硫酸,終止反應(yīng), 采取酶標(biāo)儀在450 nm波長下對(duì)吸光度進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果≥臨界值者視為陽性, 反之為陰性。

2 結(jié)果

采取雙抗原夾心法對(duì)上述標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)后, 共檢出136份HCV抗體陽性標(biāo)本, 有2份標(biāo)本沒有檢出, 經(jīng)ChironRIBA確認(rèn)試劑檢測(cè)證實(shí)這2份標(biāo)本均為陽性, 雙抗原夾心法檢測(cè)敏感性為98.55%。詳見表1。

表1 雙抗原夾心法與ChironRIBA 確認(rèn)試劑檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示［2］, HCV感染表現(xiàn)出顯著的世界性分布, 在我國HCV感染者約有4000萬, 血液傳播為其主要傳播途徑, 其中輸血為血液傳播的一種主要形式, 因此在對(duì)HCV感染血液傳播進(jìn)行有效控制的過程中, 臨床需對(duì)獻(xiàn)血者展開抗-HCV檢測(cè)?，F(xiàn)階段采取酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)抗-HCV抗體進(jìn)行檢測(cè)為臨床診斷HCV感染的主要手段。在實(shí)施抗-HCV酶聯(lián)免疫診斷時(shí)所需試劑均為二抗作酶結(jié)合物,由于血清中IgG的含量相對(duì)較高, 因此少量的特異吸附會(huì)引起假陽性結(jié)果的出現(xiàn), 進(jìn)而對(duì)診斷結(jié)果和準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。

PCR法對(duì)HCVRNA進(jìn)行檢測(cè)時(shí), 可依據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)HCV感染進(jìn)行早期診斷, 然而臨床實(shí)踐證實(shí), 該方法相對(duì)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力, 且試劑費(fèi)用也較為昂貴, 臨床普及存在困難, 特別是在基層醫(yī)院, 因此對(duì)新型有效檢測(cè)方法進(jìn)行開發(fā)具有很大的必要性, 對(duì)于HCV感染的診斷具有重要意義。

霍亂毒素B亞基融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)通過可溶性可表達(dá)獲得CTB2HCV融合蛋白抗原, 適用于酶標(biāo)記抗原的制備, 然而由于CTB與大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素B亞基(LTB)存在較強(qiáng)的免疫交叉反應(yīng), 人血清中LTB抗體含量較高, 可能對(duì)基于融合蛋白的雙抗原夾心ELISA系統(tǒng)產(chǎn)生較為嚴(yán)重的非特異性反應(yīng), 在大腸桿菌中表達(dá)了大腸桿菌噬體MS2DNA多聚酶與HCV抗原決定簇的融合蛋白, 將HRP標(biāo)記的CTB2HCV融合蛋白決定簇的融合蛋白, 對(duì)雙抗原夾心的ELISA系統(tǒng)進(jìn)行建立。

近幾年雙抗原夾心法在丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)中逐漸被應(yīng)用, 且取得了良好的效果, 曾有學(xué)者對(duì)269份HCV抗體陽性標(biāo)本采取雙抗原夾心法進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果僅3份未檢出, 檢測(cè)敏感性為98.84%［3］。本次研究中對(duì)138份HCV抗體陽性標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 雙抗原夾心法檢出136份, 僅2份標(biāo)本未檢出, 敏感性為98.55%, 與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果接近。

因雙抗原夾心法不需要對(duì)血清產(chǎn)品進(jìn)行稀釋, 不會(huì)受到類風(fēng)濕因子等因素的干擾, 具有較高的特異性, 并且同時(shí)可以對(duì)血清中各類抗體進(jìn)行檢測(cè), 特別是IgM類抗體, 有效縮短了從病毒感染到經(jīng)ELISA法檢出抗體之間的“窗口期”。因此采取雙抗原夾心ELISA法可以使HCV感染診斷試劑的特異性、檢出率得以顯著提高, 縮短了檢測(cè)時(shí)間, 臨床意義重大, 值得臨床關(guān)注并推廣。

［1］ 劉文玉.酶聯(lián)法檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體陽性分析.白求恩軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2010,12(03):175.

［2］ 喬偉振.丙型肝炎病毒不同基因型NS3蛋白的抗原異質(zhì)性分析.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2009,10(01):151.

［3］ 張桂芳.溶血對(duì)雙抗原夾心法檢測(cè)HIV抗體的影響.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志, 2010,17(13):155.