合并乙肝病毒感染對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者細(xì)胞免疫功能的影響

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院血液科，上海 200032

合并乙肝病毒感染對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者細(xì)胞免疫功能的影響

魏征 程韻楓 王志梅 鄒善華

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院血液科，上海 200032

鄒善華，副主任醫(yī)師，副教授，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院血液科副主任，中華醫(yī)學(xué)會上海分會血液學(xué)?？莆瘑T會委員兼秘書，中國淋巴瘤聯(lián)盟委員；兼任《中華血液學(xué)雜志》通訊編委及《實(shí)用內(nèi)科學(xué)》第14版編委。主要從事血液腫瘤臨床和相關(guān)研究工作。參編專著8部，在國內(nèi)外期刊上發(fā)表論文40余篇。

背景與目的：乙型肝炎病毒(hepatitis virus B，HBV)感染與彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)密切相關(guān)，前期研究發(fā)現(xiàn)在接受聯(lián)合免疫化療的DLBCL患者中，HBsAg陽性者生存較差，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí)。本研究通過分析HBV感染對DLBCL患者細(xì)胞免疫的影響，為闡明這一機(jī)制尋找細(xì)胞免疫方面的證據(jù)。方法：2004年3月—2013年6月共294例住院初治的DLBCL患者納入本研究。采用四色流式分析患者外周血CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞計(jì)數(shù)及CD4+/CD8+細(xì)胞比例，比較HBsAg陽性及陰性的DLBCL患者發(fā)病時(shí)、化療后2～4個(gè)月、化療后4～6個(gè)月及化療后6～12個(gè)月上述參數(shù)的時(shí)序改變及2組間的差異。結(jié)果：與HBsAg陰性患者相比，HBsAg陽性DLBCL患者化療前各淋巴細(xì)胞亞群差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；外周血CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)在化療后2～4個(gè)月顯著低于HBsAg陰性患者；HBsAg陽性患者CD4+/CD8+比例降低，在化療后4～12個(gè)月顯著低于HBsAg陰性患者。結(jié)論：合并HBV感染對DLBCL患者化療前細(xì)胞免疫狀態(tài)無明顯影響；HBsAg陽性的DLBCL患者化療后出現(xiàn)更為明顯和持續(xù)的細(xì)胞免疫抑制。

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤；細(xì)胞免疫；化療

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)是我國最常見的淋巴瘤病理亞型；在DLBCL患者中，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染率明顯高于其他惡性腫瘤乃至淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤，包括T細(xì)胞淋巴瘤及濾泡淋巴瘤等［1-5］。前期研究證實(shí)HBsAg陽性的DLBCL患者在接受聯(lián)合免疫化療后，獲得與HBsAg陰性患者類似的緩解率，但長期預(yù)后較差［6］。HBV慢性感染患者存在細(xì)胞免疫功能削弱，CD4+細(xì)胞減少，CD4+/CD8+比例降低的現(xiàn)象［7-8］；但HBV感染的DLBCL患者在化療過程中細(xì)胞免疫變化情況尚不明確。本研究通過分析HBsAg陽性及陰性的DLBCL患者化療前后細(xì)胞免疫差異，探索合并HBV感染對DLBCL患者細(xì)胞免疫影響的規(guī)律，為進(jìn)一步闡述HBV感染對DLBCL患者預(yù)后影響的機(jī)制建立理論基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 患者資料

順序收集2004年3月—2013年6月，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院血液科住院化療的294例DLBCL患者，其中乙肝表面抗原(HBsAg)陽性59例，HBsAg陰性235例。該回顧性研究獲復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

入選標(biāo)準(zhǔn)：①復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理確診為DLBCL的初治患者；②年齡≥16歲；③具有完整的HBsAg及乙肝核心抗體(HBcAb)初篩及隨訪資料；④完成治療前及治療后至少2次外周血淋巴細(xì)胞亞群分型檢測；⑤采用CHOP樣方案(環(huán)磷酰胺、表柔比星、長春地辛及潑尼松)或 R-CHOP樣方案(CHOP樣方案聯(lián)合利妥昔單抗)初始治療6～8個(gè)療程。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并HCV感染及HIV感染；②原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤。

1.2 臨床評價(jià)及治療

所有患者在化療前接受HBV血清標(biāo)志物檢測，包括至少HBsAg及HBcAb。病理診斷由病理科根據(jù)WHO淋巴造血腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為DLBCL［9］。病理亞型主要根據(jù)Bcl-6、CD10及Mum-1染色區(qū)分為生發(fā)中心型(germinal center B-cell like, GCB)、非生發(fā)中心型(non-germinal center B-cell like，non-GCB)［10-11］；以及其他少見的特殊亞型及無法分類的患者，包括由其他淋巴瘤亞型轉(zhuǎn)化而來的轉(zhuǎn)化型彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(transformed DLBCL，t-DLBCL)。治療前通過CT或PET-CT判斷病灶累及范圍及病灶最大徑，記錄原發(fā)病灶位置(淋巴結(jié)或結(jié)外)及評估結(jié)外病灶數(shù)目，骨髓穿刺涂片及活檢病理判斷有無骨髓累及；使用Ann-Arbor 分期對患者進(jìn)行分期分組，并使用國際預(yù)后指數(shù)(International Prognosis Index, IPI)評分［12］。

所有患者均接受改良CHOP樣或R-CHOP樣方案進(jìn)行初始誘導(dǎo)治療，具體為CHOP方案：環(huán)磷酰胺(750 mg/m2，第1天，靜脈滴注)；長春地辛(2.8 mg/m2，截頂劑量4 mg/m2，第1天，靜脈滴注)；表柔比星(70 mg/m2，第1天，靜脈滴注)，以及潑尼松(70 mg/m2，第1～5天，口服)聯(lián)合化療，21 d為1個(gè)療程；采用R-CHOP方案者在CHOP方案基礎(chǔ)上聯(lián)用利妥昔單抗(375 mg/m2，第0天，靜脈滴注)。

1.3 主要材料

四色流式檢測試劑盒MultiTEST IMK Kit購自BD公司(anti-CD3 FITC/anti-CD8 PE/anti-CD45PerCP/anti-CD4APC；anti-CD3 FITC/ anti-CDl6+CD56 PE/anti- CD45 PerCP/ant-CDl9 APC)

1.4 淋巴細(xì)胞亞群分型檢測

患者首次化療前及常規(guī)療程化療前，EDTA抗凝管抽取清晨空腹靜脈血2 mL，進(jìn)行四色抗體標(biāo)記檢測并由FACS Calibur流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，BD FACS Diva軟件分析，得到CD3、CD4、CD8和CD19陽性細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比例，并計(jì)算CD3、CD4和CD8陽性細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)待進(jìn)一步分析。根據(jù)檢測時(shí)點(diǎn)，將檢測數(shù)據(jù)分為化療前、化療后2～4個(gè)月、4～6個(gè)月及6～12個(gè)月的結(jié)果，在同一檢測時(shí)間區(qū)間內(nèi)多次結(jié)果取最末一次檢測結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組患者的一般臨床特征作為分類資料，使用χ2檢驗(yàn)比較組間差異。各組患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞亞群分類比例及絕對計(jì)數(shù)等計(jì)量資料以表示，以F檢驗(yàn)確定數(shù)據(jù)正態(tài)性，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較2組數(shù)據(jù)間均值；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者基線情況

將HBsAg陽性及陰性DLBCL患者發(fā)病時(shí)各項(xiàng)臨床特征進(jìn)行比較，包括年齡、性別、臨床分期分組、IPI分組、起病部位(淋巴結(jié)或結(jié)外)，病理亞型(生發(fā)中心來源或非生發(fā)中心來源、或轉(zhuǎn)化型DLBCL及其他少見或無法分類亞型)以及初治方案不同。各臨床特征在組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.2 外周血淋巴細(xì)胞亞群在DLBCL患者化療不同階段的變化

將HBsAg陽性及陰性DLBCL患者化療過程中不同階段外周血T淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)在組間進(jìn)行比較(表2)，可以發(fā)現(xiàn)：①HBsAg陽性患者在化療前CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞計(jì)數(shù)及CD4+/ CD8+比例與HBsAg陰性患者相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖1)；②HBsAg陽性患者CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)化療后均低于HBsAg陰性患者，以化療后2～4個(gè)月時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1A)；③HBsAg陽性患者CD4+/CD8+比例低于HBsAg陰性患者，化療后4～6個(gè)月起至化療后12個(gè)月差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1C)；④化療早期(2～4個(gè)月)時(shí)，HBsAg陽性患者CD3+細(xì)胞計(jì)數(shù)相比HBsAg陰性患者顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1D)。

表1 伴或不伴HBV感染的DLBCL患者基線情況比較Tab. 1 Comparison of the clinical characters between DLBCL patients with or without concurrent HBV infection

表2 伴或不伴有HBV感染的DLBCL患者化療過程中外周血淋巴細(xì)胞亞群比較Tab. 2 Comparison of lymphocyte subgroups in peripheral blood in different stages of chemotherapy between DLBCL patients with or without concurrent HBV infection

圖1 HBsAg陽性或陰性患者化療過程階段淋巴細(xì)胞亞群變化趨勢Fig. 1 Trend of lymphocyte subgroups in peripheral blood in different stages of chemotherapy in DLBCL patients

3 討 論

DLBCL是我國最常見的淋巴瘤病理亞型，我國DLBCL占淋巴瘤比例高達(dá)50%～60%，高于歐美國家報(bào)道的30%左右。國內(nèi)外多宗回顧性研究顯示，在DLBCL患者中，HBV感染率明顯高于其他惡性腫瘤乃至淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤，包括T細(xì)胞淋巴瘤及濾泡淋巴瘤等［1-5］。因此，HBV感染與DLBCL密切相關(guān)。前期研究證實(shí)HBsAg陽性的DLBCL患者在接受聯(lián)合免疫化療后，獲得與HBsAg陰性患者類似的緩解率，但長期預(yù)后較差［6］。HBV慢性感染患者存在細(xì)胞免疫功能削弱，CD4+細(xì)胞減少，CD4+/CD8+比例降低［7-8］；但合并HBV感染對于DLBCL患者細(xì)胞免疫變化的影響目前鮮有報(bào)道。因此本研究對于這部分患者細(xì)胞免疫變化規(guī)律的描述，對進(jìn)一步闡明HBV感染對于DLBCL患者預(yù)后影響的具體機(jī)制有重要意義。

本研究中，HBsAg陽性DLBCL患者與HBsAg陰性者的發(fā)病特征相比，在發(fā)病年齡、性別分布、淋巴瘤的分期、IPI分組及病理亞型差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HBV感染與否并未影響到淋巴瘤患者的腫瘤特性。另外，發(fā)病時(shí)HBsAg陽性患者的各主要T淋巴細(xì)胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞絕對計(jì)數(shù))分布，以及CD4+/CD8+細(xì)胞比例與HBsAg陰性患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HBV感染與否在發(fā)病初期并未對DLBCL患者的細(xì)胞免疫造成顯著影響。HBV感染與DLBCL發(fā)病之間雖然存在密切聯(lián)系，但本研究中也未發(fā)現(xiàn)HBV感染是直接造成DLBCL發(fā)病的相應(yīng)證據(jù)。

然而，DLBCL患者在化療后，HBsAg陽性患者CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)化療后均低于HBsAg陰性患者，化療后2～4個(gè)月時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在化療后HBsAg陽性DLBCL患者CD4+/CD8+比例低于HBsAg陰性患者，化療后4～6個(gè)月起至化療后12個(gè)月差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示合并HBV感染的DLBCL患者在化療后出現(xiàn)的細(xì)胞免疫抑制，不僅程度更為嚴(yán)重，而且時(shí)間較為持久。

淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，宿主的免疫因素具有很重要的作用；宿主免疫因素的削弱，使腫瘤監(jiān)視減弱，最終可導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)進(jìn)展［13］。結(jié)合本研究及前期研究結(jié)果可以推測，合并HBV感染對于DLBCL患者的腫瘤特性及發(fā)病初期的細(xì)胞免疫并無顯著影響［6］，因此患者經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化療后可以取得類似的緩解率；但由于HBsAg陽性患者存在治療后較為嚴(yán)重而持續(xù)的細(xì)胞免疫抑制，宿主免疫系統(tǒng)對于腫瘤監(jiān)視作用削弱，導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)進(jìn)展增多，最終長期預(yù)后相對較差。

總之，合并HBV感染使DLBCL患者化療后出現(xiàn)更為嚴(yán)重而持久的細(xì)胞免疫抑制，可能是導(dǎo)致其預(yù)后不良的重要因素；對這部分患者細(xì)胞免疫的監(jiān)控及進(jìn)一步深入研究，有望改變其不良預(yù)后。

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The impact of hepatitis B virus concurrent infection on peripheral T cells in diffuse large B cell lymphoma patients

WEI Zheng, CHENG Yun-feng, WANG Zhi-mei, ZOU Shan-hua
(Department of

Hematology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China)

ZOU Shan-hua E-mail: zou.shanhua@zs-hospital.sh.cn

Background and purpose: The clinical relevance of HBV infection with respect to diffuse large B cell lymphoma(DLBCL) patients and immune patterns of T lymphocyte subsets during chemotherapy remains unclear. This study aimed to identify the characteristics of T-cell mediated immunity in DLBCL patients with HBV infection, thereafter, to explore the possible cell-mediated immune mechanisms of HBsAg positive HBV infection on the survival of DLBCL. Methods: A total of 294 newly diagnosed DLBCL patients were enrolled in this cohort study. Four-color flow cytometric method was used to enumerate the absolute number of CD3+, CD4+, CD8+T lymphocytes and theCD4+/CD8+ratio in peripheral blood samples, at the onset of disease, 2-4, 4-6 and 6-12 months after the initiation of chemotherapy, individually. Results: The absolute number of CD3+, CD4+, CD8+T lymphocytes in both groups were similar at the onset of disease; the count of CD4+lymphocytes was lower in HBsAg positive group during 2 to 4 months after the initiation of chemotherapy, compared with that in the HBsAg negative group. During 4 to 12 months after chemotherapy, the CD4+/CD8+ratio in peripheral blood samples was significantly lower in HBsAg positive group. Conclusion: For newly diagnosed DLBCL patients who received chemotherapy, the dynamic nature of cell mediated immune response was characterized as a low counts of CD4+T lymphocyte during the fi rst several cycles of chemotherapy followed by a decreased circulating CD4+/CD8+ratio. Depressions of cell immunity after chemotherapy in HBsAg positive DLBCL patients were greater and prolonged.

Diffuse large B cell lymphoma; Cell immunity; Chemotherapy

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.10.009

R733

A

1007-3639(2014)10-0765-05

2014-07-15）

鄒善華 E-mail:zou.shanhua@zs-hospital.sh.cn