微小RNA-214在胰腺癌中的表達(dá)及臨床意義研究

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院普外科，上海 200233

微小RNA-214在胰腺癌中的表達(dá)及臨床意義研究

朱宏達(dá) 馬塵超 艾開(kāi)興

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院普外科，上海 200233

背景與目的：微小RNAs(microRNAs，miRNA，miR)在多種腫瘤中異常表達(dá)，可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)，被認(rèn)為可能起癌基因或抑癌基因的作用。該研究旨在檢測(cè)miR-214在胰腺癌組織中的表達(dá)情況，并探討其臨床意義。方法：實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)法檢測(cè)36例胰腺癌組織與相應(yīng)癌旁組織中miR-214的表達(dá)水平，分析miR-214表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：miR-214在69.4%(25/36)的胰腺癌組織中相對(duì)高表達(dá)，表達(dá)水平為3.45(1.73～5.13)，癌旁組織中的表達(dá)水平為1.52(1.09～2.12)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，并且在T3、T4期患者中的表達(dá)水平顯著高于T1、T2期患者(P=0.018)。Kaplan-Meier生存分析顯示，miR-214表達(dá)水平越高，患者生存期越短(P=0.032)。結(jié)論：miR-214在胰腺癌組織中的表達(dá)上調(diào)與胰腺癌的臨床病理特征及患者預(yù)后密切相關(guān)，miR-214可能成為胰腺癌診斷及預(yù)后判斷的新的分子標(biāo)志。

胰腺腫瘤；微小RNAs；預(yù)后；miR-214

胰腺癌是目前已知的惡性程度最高的腫瘤之一，其死亡率和發(fā)病率之比接近0.99∶1，在美國(guó)癌癥死亡原因中，胰腺癌居第四位，5年生存率＜5%［1］。在中國(guó)，胰腺癌發(fā)病率及死亡率呈上升趨勢(shì)，逐漸接近西方國(guó)家水平。目前，胰腺癌的治療仍首選手術(shù)切除，但由于早期診斷率低，僅10%～20%的患者在診斷時(shí)能夠得到根治性切除，且術(shù)后生存率僅為20%［2］。近年來(lái)，一類在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的非蛋白編碼微小RNAs(microRNAs，miRNA，miR)的研究，給胰腺癌的診斷與治療帶來(lái)了新的啟示。miRNA是一類長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，通過(guò)與靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)的互補(bǔ)序列相配對(duì)，降解或抑制mRNA的翻譯，導(dǎo)致靶基因的轉(zhuǎn)錄后沉默，在細(xì)胞的增殖、分化和凋亡中具有重要作用［3］。目前大量研究結(jié)果顯示miRNA能夠通過(guò)調(diào)節(jié)癌基因或抑癌基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯，促進(jìn)或抑制各種腫瘤的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌組織和非癌組織中miRNAs表達(dá)譜存在明顯差異的［4-6］，提示miRNA可能與胰腺癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡、藥物抵抗等生物學(xué)行為相關(guān)，因此其可能在胰腺癌診斷、治療和預(yù)后判斷中具有一定的應(yīng)用價(jià)值［7］。本研究旨在檢測(cè)miR-214在胰腺癌組織中的表達(dá)，探討其與臨床病理特征、臨床預(yù)后之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

胰腺癌標(biāo)本36例，取自2009年1月—2010年12月于我院普外科行胰腺癌手術(shù)切除的患者，均知情同意，并簽署書(shū)面知情同意書(shū)。其中男性23例，女性13例，年齡40～83歲，中位年齡為61歲。按腫瘤部位(胰頭和胰體尾)、腫瘤大小(≤2 cm，＞2 cm)、浸潤(rùn)深度(T1、T2及T3、T4)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管浸潤(rùn)、血管浸潤(rùn)、周圍神經(jīng)浸潤(rùn)、TNM分期(Ⅰ～Ⅱ，Ⅲ～Ⅳ)、CA199水平(≤37 ng/mL，＞37 ng/mL)進(jìn)行臨床病理資料分析，其中TNM分期依照美國(guó)癌癥委員會(huì)(AJCC)胰腺癌TNM分期(2010)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。每例患者的手術(shù)標(biāo)本均在標(biāo)本離體后10 min內(nèi)予鋒利刀片迅速切取胰腺癌及相應(yīng)癌旁組織(距癌組織＞3 cm)各5塊。所有患者術(shù)前均未經(jīng)化療、放療或免疫治療，術(shù)后病理檢查均由2位病理醫(yī)師共同診斷，且病理診斷結(jié)果顯示均為胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)。組織標(biāo)本離體后立即放入液氮，后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR RTPCR)試劑盒All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR檢測(cè)試劑盒、U6、miR-214引物購(gòu)自美國(guó)復(fù)能基因有限公司；無(wú)水乙醇、甲醇、異丙醇、氯仿、鹽酸均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；槍頭，EP管，離心管均購(gòu)自AXYGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取

將收集的胰腺癌及癌旁組織標(biāo)本從液氮罐中取出，剪切成綠豆大小塊狀，放入研缽中研磨，隨后裝入加有1 mL TRIzol的EP管，靜置5 min，加氯仿0.2 mL，混勻靜置5 min，離心(4 ℃，12 000×g，15 min)，吸取上清液，加入0.5 mL異丙醇，靜置15 min，離心(4 ℃，12 000×g，15 min)，可見(jiàn)RNA沉淀, 棄上清液, 加750 mL/L乙醇1 mL混勻，離心(4 ℃，7 500×g，5 min)，棄上清液，加入RNase free water溶解RNA沉淀。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量、紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)miR-214的表達(dá)

取總RNA 2 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件：16 ℃，30 min，42 ℃，30 min，85 ℃，10 min。取2 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：50 ℃預(yù)熱2 min；95 ℃預(yù)變性10 min(95 ℃變性15 s；60 ℃延伸1 min)共40個(gè)循環(huán)；95 ℃終延伸15 s。以上各步驟中，反應(yīng)體系以及試劑用量均嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。RT-PCR結(jié)果以Ct值表示，采用2-ΔΔCt比較各樣品間miR-214的表達(dá)差異［8］，ΔCt=待檢樣品的miR-214 Ct值-該樣品的U6 Ct值，ΔΔCt值=腫瘤組織的 ΔCt 值-癌旁組織的ΔCt值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

非正態(tài)數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，兩組間配對(duì)樣本采用Wilcoxon檢驗(yàn)，獨(dú)立樣本采用Mann-Whitney檢驗(yàn)；正態(tài)數(shù)據(jù)以表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)；利用Kaplan-Meier法繪制生存曲線以及Log-rank檢驗(yàn)比較生存率差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-214在胰腺癌組織中高表達(dá)

RT-PCR技術(shù)檢測(cè)36例胰腺癌組織和癌旁組織中miR-214的表達(dá)水平結(jié)果見(jiàn)圖1。

檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-214在69.4%(25/36)的胰腺癌組織中相對(duì)高表達(dá)，表達(dá)水平為3.45(1.73～5.13)，癌旁組織的表達(dá)水平為1.52(1.09～2.12)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖1)。

2.2 miR-214的表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征間的關(guān)系

圖1 RT-PCR檢測(cè)miR-214在胰腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)Fig. 1 RT-PCR was used to detect the miR-214 expressions in PDAC tissues and matched adjacent normal tissues

表1 胰腺癌組織中miR-214的表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系Tab. 1 Correlation between miR-214 expression levels and clinic-pathological features in PDAC＃

以胰腺癌組織中miR-214表達(dá)量的中位數(shù)為分界點(diǎn)將其分為低表達(dá)組和高表達(dá)組［9］，分析兩組與臨床病理特征間的關(guān)系(表1)。結(jié)果表明，miR-214的表達(dá)水平與胰腺癌T分期密切相關(guān)，T3、T4期患者中miR-214高表達(dá)率為66.7%(14/21)，顯著高于T1、T2期患者的26.7%(4/15)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018)，而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管浸潤(rùn)、血管浸潤(rùn)、周圍神經(jīng)浸潤(rùn)、TNM分期及CA199水平無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05，表1)。

2.3 miR-214表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

以胰腺癌組織中miR-214表達(dá)量的中位數(shù)為分界點(diǎn)將其分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，利用Kaplan-Meier法繪制生存曲線以及Log-rank檢驗(yàn)比較兩組之間生存率的差異。結(jié)果表明miR-214高表達(dá)患者的中位生存期為9.0個(gè)月，顯著低于miR-214低表達(dá)患者的20.0個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032，圖2)。

圖2 miR-214表達(dá)與胰腺癌患者的生存時(shí)間的關(guān)系Fig. 2 The relationship between the miR-214 expression and survival time of pancreatic cancer patients

3 討 論

自1993年文獻(xiàn)首次報(bào)道m(xù)iRNA以來(lái)，對(duì)miRNA的研究不斷深入。癌基因或抑癌基因的mRNA能夠成為miRNA的靶點(diǎn)，因此miRNA的失調(diào)會(huì)影響基因的表達(dá)，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。大量研究證實(shí)miRNA在乳腺癌［10］、肝癌［11］、胃癌［12］、胰腺癌［13］、結(jié)直腸癌［14］等多種惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)。一種miRNA往往可以調(diào)控多個(gè)靶基因，一個(gè)靶基因又可以被多種miRNA所調(diào)控，在腫瘤形成過(guò)程中，多條信號(hào)通路交錯(cuò)形成復(fù)雜的信息網(wǎng)絡(luò)，因此不同腫瘤的miRNA的表達(dá)譜往往不同［15］。miRNA表達(dá)譜的特異性為腫瘤的篩查、診斷、治療提供了新的思路［16］。

miR-214位于人1號(hào)染色體長(zhǎng)臂(1q24.3)的Dnm3基因內(nèi)，是miRNA家族中的一個(gè)重要分子［17］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)miR-214在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中表現(xiàn)尤為活躍，其在多種惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)，并且與患者的臨床病理特征關(guān)系密切。但在不同腫瘤中miR-214的表達(dá)情況卻不盡相同，具有一定的腫瘤特異性。Schwarzenbach等［18］發(fā)現(xiàn)在乳腺癌患者血清中miR-214呈低表達(dá)，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)。Shih等［19］發(fā)現(xiàn)miR-214在肝細(xì)胞肝癌患者中低表達(dá)，且與患者的復(fù)發(fā)及預(yù)后不良密切相關(guān)。Zhou等［20］發(fā)現(xiàn)miR-214在食管鱗癌中呈低表達(dá)并與食管鱗癌的病理分級(jí)、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。另一方面，miR-214在某些腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、增強(qiáng)對(duì)化療藥物耐藥性發(fā)揮促癌作用。Zhang等［21］發(fā)現(xiàn)miR-214在胰腺癌中高表達(dá)，并能降低癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性，可能與胰腺癌患者化療效果差密切相關(guān)。Penna等［22］發(fā)現(xiàn)miR-214在黑色素瘤中高表達(dá)，并可通過(guò)調(diào)節(jié)功能基因TFAP2C、ITGA3及多種細(xì)胞表面分子的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷徙、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

本研究結(jié)果顯示胰腺癌組織中miR-214的表達(dá)水平較癌旁組織顯著增高，提示miR-214的表達(dá)上調(diào)可能參與了胰腺癌的發(fā)生，miR-214在胰腺癌發(fā)生中可能起癌基因的作用；胰腺癌組織中miR-214的表達(dá)水平與胰腺癌的浸潤(rùn)深度(T分期)具有顯著相關(guān)性，與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管浸潤(rùn)、血管浸潤(rùn)、周圍神經(jīng)浸潤(rùn)、TNM分期及CA199水平無(wú)明顯相關(guān)，但在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者中有高表達(dá)傾向，說(shuō)明miR-214的表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)了胰腺癌的進(jìn)展；胰腺癌組織中miR-214的表達(dá)水平與胰腺癌患者的生存期及臨床預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，即表達(dá)水平越高，患者的生存期越短，這與Zhang等［21］報(bào)道的結(jié)果相似，至于是由于腫瘤本身生物學(xué)特性造成的生存期降低還是由于后期的化療干預(yù)造成的，有待進(jìn)一步研究。這些結(jié)果表明miR-214在胰腺癌組織中表達(dá)顯著升高，并且與胰腺癌的惡性程度及臨床預(yù)后相關(guān)，因此對(duì)胰腺癌的診斷及患者臨床預(yù)后的預(yù)測(cè)具有一定的指導(dǎo)意義。但是，是否適合作為胰腺癌診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)的組織分子標(biāo)志物尚需進(jìn)一步深入研究。并且本研究獲取的樣本量較小，因而確切的結(jié)論需要更多的樣本進(jìn)一步觀察驗(yàn)證。

綜上所述，miR-214在胰腺癌組織中的表達(dá)上調(diào)與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，miR-214可能成為胰腺癌診斷及預(yù)后判斷的新的分子標(biāo)志。

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The expression and clinical signi ficance of microRNA-214 in pancreatic cancer

ZHU Hong-da, MA Chen-chao, AI Kai-xing
(Department of General Surgery, Shanghai Jiao Tong University Affiliated 6thPeople’s Hospital, Shanghai 200233, China)

AI Kai-xing E-mail: akxing8258@gmail.com

Background and purpose: Aberrant expressions of microRNAs (miRNA, miR)are reported in various cancers and may associate with cancer occurrence, development, invasion and metastasis, thereby functioning as either tumor suppressors or oncogenes. This study attempted to observe the expression of miR-214 in pancreatic cancer and to explore its clinical signi ficance. Methods: Real-time PCR was used to detect the miR-214 expressions between pancreatic cancer tissues and matched adjacent tissues. The correlations of miR-214 expression with clinicpathological features and clinical prognosis were analyzed. Results: MiR-214 expression was up-regulated in 69.4% (25/36) of tumor tissue specimens. The relative expression level of miR-214 was signi ficantly higher in tumor tissues than in matched adjacent tissues (3.45 vs 1.52, P＜0.01). Higher miR-214 level was strongly associated with T3-T4stage (P=0.018). The Kaplan-Meier analysis revealed that patients with higher expression of miR-214 had a shorter survival time (P=0.032). Conclusion: The expression of miR-214 is associated with clinic-pathological features and patient’s clinical prognosis, so it may be used as a potential diagnostic biomarker and a prognostic predictor in patients with pancreatic cancer.

Pancreatic neoplasms; MicroRNAs; Prognosis; MiR-214

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.08.006

R735.9

A

1007-3639(2014)08-0594-05

2014-05-16

2014-06-16）

艾開(kāi)興 E-mail:akxing8258@gmail.com