肝細胞癌組織中FoxP3+調(diào)節(jié)性T細胞與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和患者預后的關(guān)系

徐軍王健胡勇程蘭蘭余宏宇

1.中國人民解放軍第105醫(yī)院病理科,安徽 合肥 230031；

2.第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院病理科, 上海 200003

肝細胞癌組織中FoxP3+調(diào)節(jié)性T細胞與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和患者預后的關(guān)系

徐軍1王健1胡勇1程蘭蘭1余宏宇2

1.中國人民解放軍第105醫(yī)院病理科,安徽 合肥 230031；

2.第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院病理科, 上海 200003

背景與目的：腫瘤微環(huán)境中的調(diào)節(jié)性T細胞(tumor-infiltrating regulatory T cells，Tregs)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是惡性腫瘤獲得轉(zhuǎn)移和侵襲能力的重要生物學過程，但對肝癌浸潤性Tregs與EMT之間的關(guān)系尚不清楚,本研究探討原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)組織浸潤的Tregs與EMT的關(guān)系及其臨床意義。方法：采用免疫組化和核酸原位雜交技術(shù)檢測74例原發(fā)性HCC和20例癌旁組織中Tregs標志物FoxP3和EMT標志物(E-cadherin、Vimentin蛋白和Snail mRNA)的表達。結(jié)果：HCC組織中每高倍視野的FoxP3+Tregs數(shù)為9.7(3.8～20.2)個，癌旁組織為1.7(0.5～4.2)個(P＜0.Ol),有門靜脈癌栓和鏡下癌栓的HCC組織Tregs數(shù)高于無門靜脈癌栓和鏡下癌栓組(P＜0.05)，高Tregs組術(shù)后無瘤生存率、總體生存率均低于低Tregs組(P＜0.05，P＜0.01)。Spearman相關(guān)分析表明，E-cadherin陽性率分別與另兩種EMT標志物呈負相關(guān)(Vimentin：r= -0.572，P＜0.01；Snail：r=-0.597，P＜0.01)。Tregs數(shù)量與E-cadherin呈負相關(guān)(r=-0.513，P＜0.05)，與Vimentin和Snail呈正相關(guān)(Vimentin：r=0.598，P＜0.01；Snail：r=0.423，P＜0.05)。結(jié)論：HCC組織中浸潤的Tregs有利于肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移，與EMT關(guān)系密切，并且對患者預后判斷有一定的參考價值。

肝腫瘤；肝細胞癌；調(diào)節(jié)性T細胞；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

腫瘤局部微環(huán)境中的免疫細胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［1］。調(diào)節(jié)性T細胞(tumor-infiltrating regulatory T cells，Tregs)在肝癌、乳腺癌等腫瘤組織中浸潤增多［2-3］,但其作用機制尚不完全清楚。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型的細胞，是上皮來源的惡性腫瘤獲得轉(zhuǎn)移和侵襲能力的重要生物學過程［4］，近年來EMT與腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞之間的相互作用一直是研究熱點。有研究報道利用Snail cDNA轉(zhuǎn)染大鼠黑色素瘤細胞后，除了可以誘導出EMT外還伴隨著Tregs增多引起免疫耐受，促進腫瘤轉(zhuǎn)移［5］，由此設(shè)想肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)組織中Tregs增多可能與EMT有一定關(guān)聯(lián)。本實驗采用免疫組化和核酸原位雜交技術(shù)檢測肝細胞癌中FoxP3+Tregs和EMT標志物(E-cadherin、Vimentin蛋白質(zhì)和Snail mRNA)的表達，探討HCC組織浸潤的Tregs與EMT的關(guān)系及其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

該研究經(jīng)中國人民解放軍第105醫(yī)院倫理委員會審核通過。74例原發(fā)性HCC選自2005—2012年中國人民解放軍第105醫(yī)院普外科手術(shù)切除并經(jīng)病理證實的組織，男性66例，女性8例，年齡11～85歲，中位年齡46歲，術(shù)前均未行放療和化療；Edmondson組織學分級Ⅰ+Ⅱ級53例，Ⅲ+Ⅳ級21例，UICC分期Ⅰ+Ⅱ期39例，Ⅲ+Ⅳ期35例。癌旁組織(對照組)取自距離癌灶邊緣5cm以外的非癌組織共20例。術(shù)后患者每3～6個月行常規(guī)腹部B超或彩色多普勒、胸片和甲胎蛋白檢查復發(fā)轉(zhuǎn)移情況，必要時行CT或MRI檢查，若出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復發(fā)，則為無瘤生存終止時間，隨訪采用門診復查和定期電話回訪，隨訪截止日期為2013年11月31日。

1.2 免疫組化染色

鼠抗人FoxP3單克隆抗體購自臺灣Abnova公司(克隆號2A11G9，Cat：MAB5583)，工作濃度1∶400，兔抗人E-cadherin、Vimentin單克隆抗體購自福州邁新公司(即用型)，免疫組化試劑盒Ultraview Universal DAB detection kit(D06808)為Roche公司產(chǎn)品。石蠟切片脫蠟至水，其余步驟均按在全自動免疫組化儀(BenchMark-GX，Roche公司)進行。EDTA抗原修復8 min，0.3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，二抗為HRP muitimer，DAB顯色，蘇木素復染，分別設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照。

1.3 原位雜交

人Snail mRNA原位雜交檢測試劑盒購自博士德生物工程有限公司，寡核苷酸探針序列：5’-AGAGTTTACCTTCCAGCAGCCC TACGACCAGGCCC-3’，5’-AAGGCCT T C A A C T G C A A A T A C T G C A A C A A G G A ATA-3’，5’-TACCAGTGCCAGGCGTGTGC TCGGACCTTCTCCCG-3’。石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫作用10 min，胃蛋白酶室溫消化30 min，沖洗后每張切片滴加20 μL預雜交液，濕盒放入40 ℃恒溫箱中4 h。滴加20 μL雜交液/片，38～42 ℃恒溫箱中過夜。用37 ℃預溫的2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC液先后沖洗，滴加封閉液37 ℃ 30 min，加生物素化地高辛37 ℃60 min，再加生物素化地高辛和SABC，37 ℃20 min，滴加生物素化過氧化物酶37 ℃20 min，DAB顯色，蘇木素復染，分別設(shè)陽性對照、陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷

以FoxP3核陽性的淋巴細胞數(shù)量作為組織中Tregs數(shù)量，隨機取5個高倍視野(×400)分別計數(shù)HCC組織和癌旁肝組織中Tregs絕對數(shù)，取平均數(shù)為每個樣本的FoxP3+Tregs數(shù)量。E-cadherin、Vimentin以細胞質(zhì)或膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，Snail mRNA以細胞核或質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。計數(shù)方法為隨機觀察10個×400高倍鏡視野，取平均值為陽性細胞百分數(shù)，0為0分，＜10%為1分，10%～50%為2分，51%～80%為3分，＞80%為4分；陽性強度分為弱(1分)、中等(2分)、強(3分)，兩者相乘得出總分值(0～12)。

1.5 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 19.0軟件處理，HCC和癌旁的Tregs數(shù)量以中位數(shù)和四分位數(shù)間距即M(QR)表示，2組間比較采用Mann-whitney U檢驗，HCC組織中Tregs數(shù)量與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用χ2檢驗，Tregs數(shù)量與E-cadherin、Vimentin和Snail之間的關(guān)系采用Spearman等級資料相關(guān)分析，采用Kaplan-Meier方法和Logrank檢驗進行生存分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 HCC及癌旁組織FoxP3的表達情況

FoxP3陽性細胞主要位于HCC組織和癌間質(zhì)中，為細胞核著色。HCC組織中每高倍視野(×400)的FoxP3+Tregs平均個數(shù)為9.7(3.8～20.2)個，癌旁組織為1.7(0.5～4.2)個，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，圖1)。

圖1 FoxP3在HCC和癌旁肝組織中的表達Fig. 1 Expression of FoxP3 in HCC and peritumoral tissues

2.2 HCC組織中Tregs數(shù)量與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

按Tregs中位數(shù)將樣本分成高Tregs組和低Tregs組，高表達36例，低表達38例，有門靜脈癌栓和鏡下癌栓的HCC組織FoxP3+Tregs數(shù)高于無門靜脈癌栓和鏡下癌栓組(P＜0.05，表1)。

表1 HCC中Tregs的數(shù)量與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab. 1 Relationship of FoxP3+Tregs and clinicopathologic characters of 74 HCCs

2.3 Tregs數(shù)量與HCC預后的關(guān)系

74例HCC患者，22例失訪，到隨訪截止期未復發(fā)未死亡6例、已復發(fā)未死亡5例，記為截尾值。結(jié)果顯示高Tregs組術(shù)后無瘤生存率、總體生存率均低于低Tregs組(P＜0.05，P＜0.01，圖2)。

圖2 高Treg組和低Treg組術(shù)后無瘤生存率、總體生存率的比較Fig. 2 Correlation between Tregs and the rates of recurrence-free and overall survival

2.4 Tregs數(shù)量與EMT的相關(guān)性

E-cadherin表達于部分癌細胞和正常肝細胞，細胞膜陽性，Vimentin細胞質(zhì)陽性，Snail mRNA定位于細胞質(zhì)或細胞核。Spearman相關(guān)分析表明，E-cadherin陽性率分別與另兩種EMT標志物呈負相關(guān)(Vimentin：r=-0.572，P＜0.01；Snail：r=-0.597，P＜0.01)。Tregs數(shù)量與E-cadherin呈負相關(guān)(r=-0.513，P＜0.05)，與Vimentin和Snail呈正相關(guān)(Vimentin：r=0.598，P＜0.01；Snail：r=0.423，P＜0.05，圖3)。圖3A、B、C、D均為同一例HCC組織，Tregs數(shù)量高(29個/HPF)，Vimentin和Snail表達顯著增加，而E-cadherin顯著下降。

圖3 EMT相關(guān)標志物在HCC組織中的表達Fig. 3 Expression of EMT-related markers (E-cadherin, vimentin and Snail) in HCC

3 討 論

Tregs在穩(wěn)定自身免疫環(huán)境中發(fā)揮重要作用，但在抗腫瘤免疫應答中，Tregs則主要發(fā)揮抑制效應，通過抑制CD4+和CD8+T淋巴細胞白介素2基因的轉(zhuǎn)錄和表達來抑制T淋巴細胞的活化增殖，從而營造免疫抑制微環(huán)境［6］。Foxp3是CD4+CD25+Tregs的一個特征性標志，是免疫抑制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子［7］。目前認為腫瘤局部微環(huán)境中的免疫細胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［1］。有研究顯示，HCC實驗小鼠模型的脾組織內(nèi)Tregs數(shù)目較正常小鼠顯著增加［8］，腫瘤患者外周血及腫瘤微環(huán)境中Tregs數(shù)量較正常人明顯增多，并且多種腫瘤包括乳腺癌、結(jié)腸癌等組織中Tregs數(shù)量較癌旁組織增多［7,9］。本研究顯示，HCC組織中FoxP3+Tregs數(shù)明顯高于癌旁組織，與上述研究結(jié)果基本相符，提示Tregs可以促進HCC的發(fā)生。本實驗結(jié)果還顯示，有門靜脈癌栓和鏡下癌栓的HCC組織FoxP3+Tregs數(shù)高于無門靜脈癌栓和鏡下癌栓組，提示Tregs在HCC的進展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用?？赡芤騎regss具有免疫抑制作用，與相應癌旁組織相比，癌組織Tregs浸潤明顯增多，使HCC微環(huán)境處于免疫抑制狀態(tài)，從而使肝癌細胞逃脫自身免疫監(jiān)視，促使肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果顯示，高Tregs組術(shù)后無瘤生存率、總體生存率均低于低Tregs組，癌組織Tregs浸潤越多，患者生存時間越短，提示腫瘤浸潤的Tregs數(shù)量增多不僅預示腫瘤播散、轉(zhuǎn)移的危險，還能夠預示患者的預后，與徐原林等［11］在彌漫大B細胞淋巴瘤、Bates等［12］在乳腺癌、Huang等［1］在肝癌、Salama等［13］在結(jié)直腸癌中的研究結(jié)論一致。通過檢測術(shù)后HCC標本Tregs的數(shù)量可能對腫瘤的轉(zhuǎn)移、預后做出判斷和預測。如果能去除或減少HCC患者體內(nèi)的Tregs或調(diào)節(jié)其對各種免疫活性細胞的免疫抑制功能，有可能提高HCC的免疫治療效果，從而提高HCC患者的無瘤生存率和總體生存率。但該結(jié)果是建立在組織病理學上，必須提供肝穿或手術(shù)切除標本用于檢測，下一步需檢測外周血Tregs水平并研究其與患者預后的關(guān)系，以便全面探討Tregs的預后價值。

EMT在癌癥浸潤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。有研究顯示，在腫瘤侵襲前沿的細胞發(fā)生EMT后可獲得移動、抗凋亡能力以及保持干細胞樣特性等［14］。近年來，EMT與腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞之間的相互作用一直是研究熱點，但對HCC浸潤性Tregs與EMT之間的關(guān)系尚不清楚。研究報道利用Snail cDNA轉(zhuǎn)染大鼠黑色素瘤細胞和脾細胞共培養(yǎng)可以誘導出EMT，另外還伴隨著Tregs增多引起免疫耐受，促進腫瘤轉(zhuǎn)移［5］。Snail是一種含鋅指結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合蛋白，可以結(jié)合E-cadherin啟動子部位的E-box連接基序，抑制E-cadherin基因的表達及上調(diào)Vimentin的表達，引起上皮細胞向間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生EMT，是關(guān)鍵的EMT調(diào)控因子［15］。本研究通過檢測E M T標志物E-cadherin、Vimentin蛋白和Snail mRNA在HCC組織中的表達，結(jié)果顯示E-cadherin表達與Vimentin和Snail表達呈負相關(guān)，證實了HCC組織中EMT現(xiàn)象的存在。本研究結(jié)果還顯示，Tregs的數(shù)量與E-cadherin呈負相關(guān)，與Vimentin和Snail呈正相關(guān)，說明HCC組織中浸潤的FoxP3+Tregs對EMT有重要影響。綜上所述，HCC組織中浸潤的Tregs有利于肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移，與肝癌細胞的EMT關(guān)系密切，并且對患者預后判斷有一定的參考價值，可作為治療靶點成為控制腫瘤轉(zhuǎn)移的策略之一。今后有必要通過體外實驗進一步明確，在HCC中，是Tregs誘導了EMT，還是EMT激發(fā)了Tregs的免疫活性。

［1］ HUANG Y, WANG F, WANG Y, et al. Intrahepatic IL-17+ T cells and FoxP3+ Tregss cooperate to promote development and affect the prognosis of hepatocellular carcinoma［J］. J Gastroenterol Hepatol, 2014, 29: 851-859.

［2］ GUO C L, YANG H C, YANG X H. Associations between infiltrating lymphocyte subsets and hepatocellular carcinoma［J］. Asian Pacific J Cancer Prev, 2012, 13 (11): 5909-5913.

［3］ 王鴻雁, 史秦峰, 孫穎, 等. 人乳腺癌組織及局部引流淋巴結(jié)中調(diào)節(jié)性T細胞分析［J］. 中華病理學雜志，2013, 42(2): 95-100.

［4］ DING W, YOU H, DANG H, et al. Epithelial-to-mesenchymal transition of murine liver tumor cells promotes invasion［J］. Hepatology, 2010, 52: 945-953.

［5］ KUDO-SAITO C, SHIRAKO H, TAKEUCHI T, et al. Cancer metastasis is accelerated through immunosuppression during Snail-induced EMT of cancer cells［J］. Cancer Cell, 2009, 15(3): 195-206.

［6］ DE REZENDE L C, SIKVA I V, RANGEL L B, et a1．Regulatory T cell as a target for cancer therapy［J］. Arch Immunol Ther Exp(Warsz), 2010, 58(3): 179-190.

［7］ FONTENOT J D, GAVIN M A, RUDENSKY A Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells［J］. Natu Immu, 2003, 4(4): 330-336.

［8］ DU Y, CHENX, HUANG Z M, et a1. Increased frequency of FoxP3+ regulatory T cells in mice with hepatocellular carcinoma［J］. Asian Pac J Cancer Prev, 2012, 13(8): 3815-3819.

［9］ ZHANG J Y,SONG C H，SHI F,et a1. Decreased ratio of Tregs cells to Thl7 cells correlates with HBV DNA suppression in chronic hepatitis B patients undergoing entecavir treatment［J］. PLoS One, 2010, 5(11): e13869．

［10］ ZHOU L, FU J L, LU Y Y, et a1. Regulatory T cells are associated with post-cryoablation prognosis in patients with hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma［J］. J Gastrcenterol, 2010, 45(9): 968-978．

［11］ 徐原林, 王華慶, 錢正子, 等. M2型巨噬細胞和調(diào)節(jié)性T細胞在彌漫性大B細胞淋巴瘤組織中的含量及其與患者預后的關(guān)系［J］. 中華腫瘤雜志, 2013, 35(6): 450-455.

［12］ BATES G J, FOX S B, HAN C, et a1. Quantification of regulatory T cells enables the identifieation of high-risk breast cancer patients and those at risk of late relapse［J］. J Clin Oncol, 2006, 24(34): 5373-5380.

［13］ SALAMA P, PHILLIPS M, GRIEU F, et a1. Tumor-infiltrating FoxP3+ T regulatory cells show strong prognostic significance in colorectal cancer［J］．J Clin Oncol, 2009, 27(2): 186-192.

［14］ IWATSUKI M, MIMORI K, YOKOBORI T, et a1. Epithelialmesenchymal transition in cancer development and its clinical significance［J］. Cancer Sci, 2010, 101(2): 293-299.

［15］ 黃慶, 胡榮林, 焦興元, 等. 組蛋白去乙?；敢种苿┩ㄟ^Snail誘導肝卵圓細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［J］. 中華肝膽外科雜志, 2012, 18(12): 926-932.

The relationship of the tumor-in fi ltrating FoxP3+Tregs with epithelial-mesenchymal transition and prognosis of hepatocellular carcinoma

XU Jun1, WANG Jian1, HU Yong1, CHENG Lan-lan1, YU Hong-

yu2
(1.Department of Pathology, the 105thHospital of PLA, Hefei Anhui 230031, China; 2. Department of Pathology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)

XU Jun E-mail: doctorxujun@163.com

Background and purpose: Tumor-in fi ltrating regulatory T cells (Tregs) play an important role in the development of various cancers, Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a key step toward cancer metastasis, but the interaction between Tregs and EMT has not yet been evaluated. We aimed to investigate the relationship of FoxP3+ Tregs and epithelial-mesenchymal transition (EMT) in hepatocellular carcinoma (HCC) and to determine the clinical signi fi cance of Tregs. Methods: Seventy-four sets of patient-matched tumors and twenty sets of peritumoral tissues were obtained during curative resection for HCC. The expression of FoxP3, E-cadherin, Vimentin protein and Snail mRNA was detected by immunohistochemistry and in situ hybridization histochemistry in formalin- fi xed and paraf fi n-embedded tissues. Results: The average number of intratumoral Tregs was signi fi cantly higher than that in corresponding peritumoral tissues [9.7 (3.8-20.2) vs 1.4 (0.5-4.2), respectively; P＜0.01]. The number of intratumoral Tregs was positively correlated with potal vein tumor thrombus and microvascular invasion (P＜0.05). Increased number of intratumoral Tregs was signi fi cantly associated with decreased rates of recurrence-free and overall survival (P＜0.05, P＜0.01). There was a signi fi cant negative correlation between E-cadherin and the other EMT-related markers (Vimentin: r=-0.572, P＜0.01, Snail: r=-0.597, P＜0.01). Increased number of intratumoral Tregs was characterized by increased expression of EMT-related proteins (Vimentin: r=0.598, P＜0.01; Snail: r=0.423, P＜0.05) and loss of E-cadherinexpression(r=-0.513, P＜0.05). Conclusion: Intratumoral in fi ltration by Tregs is closely related to metastasis and EMT in HCC, FoxP3+ Tregs may be a potential prognostic indicator for HCC patients.

Hepatocellular neoplasms; Hepatocellular carcinoma; Tregs; Epithelial mesenchymal transition

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.12.006

R735.7

A

1007-3639(2014)12-0914-06

2014-07-24

2014-09-12）

徐軍 E-mail:doctorxujun@163.com