不同發(fā)酵條件對毛殼菌產木聚糖酶的影響

遲莉等

摘 要：通過對毛殼菌產木聚糖酶改變發(fā)酵條件，探討毛殼菌木聚糖酶的生產能力及不同酶解條件對毛殼菌產生的木聚糖酶的影響，以確定其最佳培養(yǎng)基及發(fā)酵條件。結果表明，以玉米芯4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%為發(fā)酵基質對產酶最為有利，當溫度為39℃、pH4.6、發(fā)酵時間3d時產酶效果最好。

關鍵詞：毛殼菌；木聚糖酶；發(fā)酵；優(yōu)化

中圖分類號 Q939.9 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）08-46-03

Abstract：The experiment discusses the ability of Chaetomium xylanase production and the different affects of Enzymolysis conditions of xylanase Chaetomium，determine the most suitable medium and fermentation conditions through changing the Chaetomium fermentation condition of xylanase. The result showed that，with corn cob 4%+peptone 0.5%+yeast powder 0.5% as fermentation substrate of enzyme is most advantageous，when the temperature is 39℃，pH4.6，fermentation time 3D enzyme producing the best effect.

Key words：Chaetomium；Xylanase；Fermentation；Optimization

木聚糖是自然界中的一種豐富的再生資源，是最具代表性的半纖維素，是除纖維素外自然界中最豐富的多糖，其部分降解可形成低聚木糖[1-2]。低聚木糖是目前國際上極受關注的功能性低聚糖，是一種新型的食品添加劑，是目前食品工業(yè)研究開發(fā)的熱點[3-6]。

木聚糖酶是木聚糖水解酶系中最關鍵的水解酶，在自然界分布相當廣泛，由于其有著廣泛的應用價值，越來越多的研究者對其進行了廣泛而深入的研究。添加劑中使用的木聚糖酶多數(shù)是由微生物發(fā)酵生產的，分為固體發(fā)酵和液體發(fā)酵2種，而優(yōu)化發(fā)酵條件對木聚糖酶的生產十分重要[7-8]。據(jù)了解，產木聚糖酶的微生物有幾十個屬、100多種，主要來源于細菌和真菌，其中微生物多為木霉、曲霉、青霉、鏈霉菌等真菌及芽孢桿菌[9-11]，研究者們仍在不斷地尋找自然界中能高效表達木聚糖酶的菌種。

毛殼菌屬為常見的霉腐菌，大多數(shù)具有較強的纖維素分解能力，鑒于毛殼菌屬木聚糖酶的高產，本試驗以角毛殼菌（Chaetomium cupreum sp.）作為研究對象，探討溫度、pH及培養(yǎng)基質、酶解條件對其發(fā)酵產酶的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 角毛殼菌（Chaetomium cupreum sp.），為黑龍江八一農墾大學生命學院實驗室保藏。

1.1.2 儀器 恒溫培養(yǎng)箱，752光柵分光光度計，恒溫水浴鍋（Hws24型），臺式離心機，微量式移液器等。

1.1.3 培養(yǎng)基 （1）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯600g，去皮，洗凈，平均切成3份小碎塊，用紗布包好。將包好的馬鈴薯分別放入3個裝有沸水的搪瓷杯中，煮沸20min。取出煮好的馬鈴薯，將剩余馬鈴薯汁液擠出，每杯加水定容至1 000mL。分別在每個杯中加入20g葡萄糖、2g MgSO4、1g KH2PO4和5g瓊脂粉，攪勻、封口、滅菌待用。（2）產酶培養(yǎng)基：選擇6種不同的發(fā)酵培養(yǎng)基，具體的配方：①麩皮4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%。②玉米芯4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%。③麩皮+玉米芯4%（1∶1）+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%。④麩皮+玉米芯4%（1∶3）+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%。⑤麩皮+玉米芯4%（1∶1）+（NH4）2SO4 2.0%+K2HPO40.1%+MgSO4 0.02%。⑥麩皮+玉米芯4%（1∶1）+KNO32.0%+K2HPO40.1%+MgSO40.02%。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化 將斜面試管中保存的毛殼菌種轉入PDA平板中，倒置于28℃溫箱中培養(yǎng)，菌落長好后待用。

1.2.2 液體發(fā)酵產酶試驗 250mL三角瓶裝100mL培養(yǎng)液，取角毛殼菌的孢子懸液接種，搖床轉速140r·min-1，在27℃下培養(yǎng)。取發(fā)酵液用2層濾紙過濾，取上清液（粗酶液）留待測定木聚糖酶酶活。

（1）角毛殼菌孢子懸液制備：取已經培養(yǎng)好并產孢的毛殼菌，放于1.5mL Appendorf管中，加入無菌水并在震蕩器上震蕩，使子囊中的子囊孢子盡量釋放出來，同時將Appendorf管中的菌懸液稀釋至107個孢子·mL-1后待用。

（2）酶活測定方法：準確量取0.1mL酶液于試管中，加入1mL 2%的木聚糖醋酸緩沖溶液，50℃恒溫15min，加入1mL 3，5-二硝基水楊酸（DNS）試液，沸水煮沸5min顯色，冷卻，定容至10mL，于540nm處讀取吸光度值（以木糖計）。以蒸餾水加DNS液作空白[6]。

1.2.3 不同發(fā)酵基質對產酶的影響 以1.1.3中的培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，液體發(fā)酵產酶方法同1.2.2，培養(yǎng)后，每天定時測量酶活，并同時于不同的pH緩沖液（pH4.2、4.6、5.0、5.4）及溫度（33、35℃）下測量，確定最適宜產酶的發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2.4 不同酶解條件對酶活性的影響 采用正交試驗設計，測定pH、溫度和發(fā)酵時間3個因素在2個水平上對木聚糖酶產生量的影響。endprint

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)酵基質對產酶的影響

2.1.1 不同酶解溫度對不同基質發(fā)酵液木聚糖酶的影響 實驗結果表明：33℃的酶解溫度下，不同基質下發(fā)酵獲得的木聚糖酶酶活變化比較大，無論發(fā)酵3d還是4d，均以第5種基質的木聚糖酶活力最高，即以麩皮+玉米芯4%（1：1）+（NH4）2SO42.0%+K2HPO40.1%+MgSO40.02%為基質產酶能力最強，而3，4或6基質都對產木聚糖酶不利，通過1，2培養(yǎng)基質的比較可以看出，玉米芯的加入有利于木聚糖酶的產生；但在35℃時，結果稍有改變，即發(fā)酵4d，基質2玉米芯4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%對產酶最為有利（見圖1、圖2）。

分析不同酶解溫度的試驗結果發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)基質的綜合表現(xiàn)中，均以2號培養(yǎng)基質的產酶能力較強，因此在利用毛殼菌生產木聚糖酶時，可以選用玉米芯4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%為基本培養(yǎng)基。

2.1.2 不同酶解pH對不同基質發(fā)酵液木聚糖酶的影響 不同培養(yǎng)基質發(fā)酵液的產酶是否受到pH的影響，對不同的對發(fā)酵3d的培養(yǎng)基進行過濾，獲得粗酶液后，測定木聚糖酶活力。結果表明，在不同酶解pH條件下，均以2號基質產酶能力最高，盡管在5號培養(yǎng)基上產酶能力也有較高值出現(xiàn)，但總體上還是以2號基質最為適宜（見表3）。故綜合溫度試驗，應選用2號基質作為毛殼菌木聚糖酶粗酶液酶的生產。

但發(fā)酵4d的培養(yǎng)基質，過濾獲得粗酶液后，同樣在不同的pH酶解條件下，測定木聚糖酶的活性，結果表明，在4.2與4.6時（見圖3），以2號培養(yǎng)基最為適宜產酶，而當pH提高到5.0和5.4時，卻以5號培養(yǎng)基對產酶最為有利（見圖4），這與以往的結果不同，不同酶解pH是否會影響發(fā)酵液酶的活性還有待于進一步研究。

2.2 不同酶解條件對酶活性的影響 從表2可以看出，當毛殼菌在溫度為39℃，pH為4.6，培養(yǎng)時間3d時，產生木聚糖酶量最大。

3 結論

以毛殼菌為研究材料，改變發(fā)酵基質，發(fā)酵獲得木聚糖酶，不同酶解溫度及pH、不同基質中研究發(fā)現(xiàn)，幾乎均為培養(yǎng)基質2產酶活性最高，即玉米芯4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%對產酶最為有利；改變不同酶解條件，探討溫度、發(fā)酵時間、pH對發(fā)酵液酶活性的影響，結果表明，當溫度為39℃、pH4.6、發(fā)酵時間3d時，產酶效果最好。

參考文獻

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[9]蔡愛華，何成新，曾健智.用于生產低聚木糖的木聚糖酶菌株篩選[J].廣西科學，2004，11（4）：339-342.

[10]Bim Monica Andrea，Telma Teixeira Franco. Extraction in aqueous two-phase systems of alkaline xylanase produced by Bacillus pumilus and its application in kraft pulp bleaching [J].Journal of Chromatography B，2000，743：349-356.

[11]Teotia Sunita，R.Lata，M.N.Gupta.Free Polymeric Bioligands in Aqueous Two-Phase Affinity Extractions of Microbial Xylanases and Pullulanase[J].Protein Expression and Purification，2001，22：484-488.

（責編：張宏民）endprint

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)酵基質對產酶的影響

2.1.1 不同酶解溫度對不同基質發(fā)酵液木聚糖酶的影響 實驗結果表明：33℃的酶解溫度下，不同基質下發(fā)酵獲得的木聚糖酶酶活變化比較大，無論發(fā)酵3d還是4d，均以第5種基質的木聚糖酶活力最高，即以麩皮+玉米芯4%（1：1）+（NH4）2SO42.0%+K2HPO40.1%+MgSO40.02%為基質產酶能力最強，而3，4或6基質都對產木聚糖酶不利，通過1，2培養(yǎng)基質的比較可以看出，玉米芯的加入有利于木聚糖酶的產生；但在35℃時，結果稍有改變，即發(fā)酵4d，基質2玉米芯4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%對產酶最為有利（見圖1、圖2）。

分析不同酶解溫度的試驗結果發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)基質的綜合表現(xiàn)中，均以2號培養(yǎng)基質的產酶能力較強，因此在利用毛殼菌生產木聚糖酶時，可以選用玉米芯4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%為基本培養(yǎng)基。

2.1.2 不同酶解pH對不同基質發(fā)酵液木聚糖酶的影響 不同培養(yǎng)基質發(fā)酵液的產酶是否受到pH的影響，對不同的對發(fā)酵3d的培養(yǎng)基進行過濾，獲得粗酶液后，測定木聚糖酶活力。結果表明，在不同酶解pH條件下，均以2號基質產酶能力最高，盡管在5號培養(yǎng)基上產酶能力也有較高值出現(xiàn)，但總體上還是以2號基質最為適宜（見表3）。故綜合溫度試驗，應選用2號基質作為毛殼菌木聚糖酶粗酶液酶的生產。

但發(fā)酵4d的培養(yǎng)基質，過濾獲得粗酶液后，同樣在不同的pH酶解條件下，測定木聚糖酶的活性，結果表明，在4.2與4.6時（見圖3），以2號培養(yǎng)基最為適宜產酶，而當pH提高到5.0和5.4時，卻以5號培養(yǎng)基對產酶最為有利（見圖4），這與以往的結果不同，不同酶解pH是否會影響發(fā)酵液酶的活性還有待于進一步研究。

2.2 不同酶解條件對酶活性的影響 從表2可以看出，當毛殼菌在溫度為39℃，pH為4.6，培養(yǎng)時間3d時，產生木聚糖酶量最大。

3 結論

以毛殼菌為研究材料，改變發(fā)酵基質，發(fā)酵獲得木聚糖酶，不同酶解溫度及pH、不同基質中研究發(fā)現(xiàn)，幾乎均為培養(yǎng)基質2產酶活性最高，即玉米芯4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%對產酶最為有利；改變不同酶解條件，探討溫度、發(fā)酵時間、pH對發(fā)酵液酶活性的影響，結果表明，當溫度為39℃、pH4.6、發(fā)酵時間3d時，產酶效果最好。

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[11]Teotia Sunita，R.Lata，M.N.Gupta.Free Polymeric Bioligands in Aqueous Two-Phase Affinity Extractions of Microbial Xylanases and Pullulanase[J].Protein Expression and Purification，2001，22：484-488.

（責編：張宏民）endprint

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)酵基質對產酶的影響

2.1.1 不同酶解溫度對不同基質發(fā)酵液木聚糖酶的影響 實驗結果表明：33℃的酶解溫度下，不同基質下發(fā)酵獲得的木聚糖酶酶活變化比較大，無論發(fā)酵3d還是4d，均以第5種基質的木聚糖酶活力最高，即以麩皮+玉米芯4%（1：1）+（NH4）2SO42.0%+K2HPO40.1%+MgSO40.02%為基質產酶能力最強，而3，4或6基質都對產木聚糖酶不利，通過1，2培養(yǎng)基質的比較可以看出，玉米芯的加入有利于木聚糖酶的產生；但在35℃時，結果稍有改變，即發(fā)酵4d，基質2玉米芯4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%對產酶最為有利（見圖1、圖2）。

分析不同酶解溫度的試驗結果發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)基質的綜合表現(xiàn)中，均以2號培養(yǎng)基質的產酶能力較強，因此在利用毛殼菌生產木聚糖酶時，可以選用玉米芯4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%為基本培養(yǎng)基。

2.1.2 不同酶解pH對不同基質發(fā)酵液木聚糖酶的影響 不同培養(yǎng)基質發(fā)酵液的產酶是否受到pH的影響，對不同的對發(fā)酵3d的培養(yǎng)基進行過濾，獲得粗酶液后，測定木聚糖酶活力。結果表明，在不同酶解pH條件下，均以2號基質產酶能力最高，盡管在5號培養(yǎng)基上產酶能力也有較高值出現(xiàn)，但總體上還是以2號基質最為適宜（見表3）。故綜合溫度試驗，應選用2號基質作為毛殼菌木聚糖酶粗酶液酶的生產。

但發(fā)酵4d的培養(yǎng)基質，過濾獲得粗酶液后，同樣在不同的pH酶解條件下，測定木聚糖酶的活性，結果表明，在4.2與4.6時（見圖3），以2號培養(yǎng)基最為適宜產酶，而當pH提高到5.0和5.4時，卻以5號培養(yǎng)基對產酶最為有利（見圖4），這與以往的結果不同，不同酶解pH是否會影響發(fā)酵液酶的活性還有待于進一步研究。

2.2 不同酶解條件對酶活性的影響 從表2可以看出，當毛殼菌在溫度為39℃，pH為4.6，培養(yǎng)時間3d時，產生木聚糖酶量最大。

3 結論

以毛殼菌為研究材料，改變發(fā)酵基質，發(fā)酵獲得木聚糖酶，不同酶解溫度及pH、不同基質中研究發(fā)現(xiàn)，幾乎均為培養(yǎng)基質2產酶活性最高，即玉米芯4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%對產酶最為有利；改變不同酶解條件，探討溫度、發(fā)酵時間、pH對發(fā)酵液酶活性的影響，結果表明，當溫度為39℃、pH4.6、發(fā)酵時間3d時，產酶效果最好。

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[8]李惠軍，劉暢.木聚糖酶高產菌株的篩選及固態(tài)發(fā)酵條件的研究[J].鄭州牧業(yè)工程高等專科學校學報，2007，27（3）：10-12.

[9]蔡愛華，何成新，曾健智.用于生產低聚木糖的木聚糖酶菌株篩選[J].廣西科學，2004，11（4）：339-342.

[10]Bim Monica Andrea，Telma Teixeira Franco. Extraction in aqueous two-phase systems of alkaline xylanase produced by Bacillus pumilus and its application in kraft pulp bleaching [J].Journal of Chromatography B，2000，743：349-356.

[11]Teotia Sunita，R.Lata，M.N.Gupta.Free Polymeric Bioligands in Aqueous Two-Phase Affinity Extractions of Microbial Xylanases and Pullulanase[J].Protein Expression and Purification，2001，22：484-488.

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