百草枯降解菌的分離鑒定及降解特性研究

韓欣等

摘 要：從沾化百草枯污染土壤中富集、篩選、分離出3株具有百草枯降解能力的菌株，進(jìn)一步研究了這3株優(yōu)勢(shì)菌的生理生化特征及最佳生長(zhǎng)條件。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和生理生化指標(biāo)的測(cè)定，對(duì)這3株菌種進(jìn)行鑒定，初步確定：BCK-1為顫螺菌屬，BCK-2為梭菌屬，BCK-3為芽孢鹽桿菌屬。這3株菌株在37℃培養(yǎng)3d后，發(fā)現(xiàn)這3株菌株（BCK-1，BCK-2，BCK-3）對(duì)百草枯的降解率分別為79.35%、80.26%和86.22%。3株優(yōu)勢(shì)菌種可應(yīng)用于受百草枯污染的菌源土壤的生物恢復(fù)。

關(guān)鍵詞：百草枯降解菌；分離；鑒定

中圖分類號(hào) S48 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2014）08-38-03

Abstract：Three strains were isolated from the Zhanhua paraquat contaminated soil，and optimal growth conditions were further studied on the physiological and biochemical characteristics of the three dominant bacteria. The Determination by morphological observation，physiological and biochemical indicators were identified，these three strains are initially identified BCK-1 Oscillosporia Chatton&Perard，BCK-2 for Clostridium Prazmowski，BCK-3 Sporohalobacter Orenetal. These three strains at 37℃ after 3d found three strains （BCK-1，BCK-2，BCK-3）and the degradation rate of paraquat were 79.35%，80.26% and 86.22%，respectively. The three dominant strain can be applied to paraquat contaminated bacteria source soil biological recovery.

Key words：Paraquat degrading bacteria；Separate；Appraisal

百草枯是一種被廣泛使用的人工合成有機(jī)農(nóng)藥，具有殺草活性高、選擇性強(qiáng)、用量少等優(yōu)點(diǎn)，已成為濱州地區(qū)用量最大的除草劑之一。但在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的同時(shí)，百草枯也不可避免的在土壤中殘留[1]，從而抑制土壤中微生物的生長(zhǎng)，降低土壤的肥力，以及對(duì)非靶標(biāo)的陸上或水生生物產(chǎn)生危害，最終影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和人們的身體健康[2]。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用微生物降解農(nóng)藥殘留具有安全性好、效果好、費(fèi)用低、處理徹底、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)。利用微生物降解百草枯及修復(fù)被污染的土壤[3]，將具有十分廣泛的應(yīng)用前景[4]。目前，國(guó)外所報(bào)告的對(duì)百草枯有降解作用的微生物主要有放線菌、真菌、細(xì)菌等，我國(guó)關(guān)于百草枯降解菌的報(bào)道較少，其中在《百草枯降解菌研究初報(bào)》中，延安大學(xué)高小朋、王海虹、陳彥羽從長(zhǎng)期噴施百草枯的土壤中經(jīng)富集、篩選[5]，得到4株百草枯降解菌。

本研究從濱州沾化百草枯污染的土壤中富集、篩選、分離出3株降解菌株，并且通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特征的測(cè)定對(duì)其進(jìn)行了初步鑒定，同時(shí)進(jìn)一步研究了它們的最佳生長(zhǎng)條件和降解特性。

1 材料與方法

1.1 供試材料 菌株來(lái)源：濱州沾化百草枯污染土壤；培養(yǎng)基：富集培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、以百草枯為唯一碳源的培養(yǎng)基、全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌源的富集 從長(zhǎng)期使用百草枯的農(nóng)田中取土樣，富集培養(yǎng)。

1.2.2 百草枯降解菌株的分離[6] （1）制備菌懸稀釋液：稀釋度到10-5稀釋液，待用。（2）分離單菌株：將稀釋后的稀釋菌液分別涂布到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)48～72h。隨后在以百草枯為唯一碳源培養(yǎng)基上劃線分離。培養(yǎng)后，挑取單菌落接種于斜面保藏在4℃冰箱中。

1.2.3 菌株降解百草枯 挑取平板上的單菌落按4%的接種量接入以百草枯為唯一碳源的液體培養(yǎng)基[7]，28℃、150r/min條件下振蕩培養(yǎng)2d。在相同的培養(yǎng)條件下，設(shè)置不接種的以百草枯為唯一碳源的液體培養(yǎng)基作對(duì)照。

1.2.4 選出優(yōu)勢(shì)菌種并測(cè)定降解率 以稀釋涂平板法、分光光度計(jì)法進(jìn)行優(yōu)勢(shì)菌種培養(yǎng)和降解率的測(cè)定。百草枯降解率的計(jì)算[8]：百草枯降解率（%）=[（對(duì)照濃度-樣品濃度）/對(duì)照濃度]×100。

1.2.5 優(yōu)勢(shì)菌種菌落的形態(tài)觀察 用放大鏡進(jìn)行觀察菌落形狀、大小、顏色、光澤度、粘稠度、邊緣、隆起狀態(tài)、透明度等。

1.2.6 優(yōu)勢(shì)菌種生理特征的測(cè)定 參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[9]分別從革蘭氏染色，運(yùn)動(dòng)性測(cè)定，芽孢，光鏡下觀察個(gè)體形態(tài)、生長(zhǎng)溫度及耐受性這5個(gè)方面進(jìn)行了測(cè)定。

1.2.7 優(yōu)勢(shì)菌種生化特征測(cè)定 參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[9]分別從糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，甲基紅（M.R）實(shí)驗(yàn)，V-P實(shí)驗(yàn)，吲哚實(shí)驗(yàn)這4個(gè)方面進(jìn)行了測(cè)定。

1.2.8 優(yōu)勢(shì)菌種最適生長(zhǎng)條件的測(cè)定 （1）測(cè)定生長(zhǎng)量[11]：用可見(jiàn)光分光光度法測(cè)定各溫度下菌液的OD值（600nm），確定生長(zhǎng)量。（2）測(cè)定最適pH、最適溫度、最適NaCl濃度、最適百草枯濃度[12]。

1.2.9 菌體生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 按沈萍等[13]方法進(jìn)行菌體生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。endprint

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)勢(shì)菌的形態(tài)特征、生理生化特征 由表1、2可初步確定，BCK-1為顫螺菌屬，BCK-2為梭菌屬，BCK-3為芽孢鹽桿菌屬[14]。

2.2 優(yōu)勢(shì)菌種最適生長(zhǎng)條件 由圖1中各個(gè)曲線圖可知：BCK-1（顫螺菌屬）：最適pH7.4～7.6，最適溫度t=20℃，NaCl濃度為3%，百草枯濃度為1.6μL/mL；BCK-2（梭菌屬）：最適pH7.4～7.6，最適溫度t=28℃，NaCl濃度為3%～5%，百草枯濃度為2μL/mL；BCK-3（芽孢鹽桿菌屬）：最適pH6.9～7.1，最適溫度t=24℃，NaCl濃度為7%，百草枯濃度為2μL/mL。

2.3 優(yōu)勢(shì)菌株的降解率 由表3可知，3株優(yōu)勢(shì)降解菌降解百草枯的能力較好，降解率均在80%左右，其中BCK-3降解效果優(yōu)于其他2株菌。

3 結(jié)論與討論

本研究中，從濱州沾化長(zhǎng)期使用百草枯的土壤中富集、篩選分離出3株具有百草枯降解能力的菌株，并進(jìn)一步研究了這3株優(yōu)勢(shì)菌的生理生化特征及最佳生長(zhǎng)條件。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和生理生化指標(biāo)的測(cè)定，對(duì)這3株菌種進(jìn)行鑒定，初步確定：BCK-1為顫螺菌屬，BCK-2為梭菌屬，BCK-3為芽孢鹽桿菌屬。這3株菌株在37℃培養(yǎng)3d后，發(fā)現(xiàn)其在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)百草枯的降解率分別為79.35%、80.26%、86.22%?？赡苡捎谶@3株優(yōu)勢(shì)降解菌分離自黃河三角洲腹地的鹽堿地，具有較強(qiáng)的耐鹽能力[15]。因此，這3株優(yōu)勢(shì)菌種可應(yīng)用于受百草枯污染的菌源土壤的生物恢復(fù)。

參考文獻(xiàn)

[1]吳志鳳，秦冬梅.百草枯在土壤中的安全性及殘留檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)介[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理，2003，24（3）：8-12.

[2]鄧曉，唐群鋒.百草枯對(duì)土壤微生物影響的研究[J].中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，10（4）：146-149.

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[4]阮少江，劉潔，趙永芳，等.微生物降解甲胺磷農(nóng)藥的進(jìn)展[J].寧德師專學(xué)報(bào)，2000，12（3）：177-180.

[5]高小朋，王海虹，陳彥羽.百草枯降解菌研究初報(bào)[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，08（10）：3 302-3 303.

[6]張德濤，曾蕊，楊媚，等.真菌對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥生物降解的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，（5）：2 558-2 561.

[7]李春艷，李艷春，成小松，等.一株丁草胺降解菌的分離鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（2）：347-353.

[8]魏敏，李玉江.微生物降解土壤殘留農(nóng)藥的研究進(jìn)展[J].山東化工，2007，16（03）：15-17.

[9]東秀珠，蔡妙英，等.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2001.2.

[10]楊革.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程（第1版）[M].北京：科學(xué)出版社，2007.

[11]黃紹重.可見(jiàn)光光度法測(cè)定Fe（Ⅲ）的研究進(jìn)展[J].化學(xué)世界，2007，4：248-251.

[12]李穎，賈麗娜，張鵬.高效生物修復(fù)菌株的篩選及其降解能力的研究[J].化工環(huán)保，2004，24（S）：15-17.

[13]沈萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（第3版）[M].北京：高等教育出版社，2001.

[14]Cheng HR，Jiang N.Extremely rapid extraction of DNA from bacteria and yeasts[J].Biotechnology Letters，2006，28：55-59.

[15]Karen MK，Sherry LH，Douglas CN.Novel，attached，sulfur-oxidizing bacteria at shallow hydrothermal ventspossess vacuoles not involved in respiratory nitrate accu-mulation[J].Appl Environ Microbiol，2004，70：7 487-7 496.

（責(zé)編：張宏民）endprint

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)勢(shì)菌的形態(tài)特征、生理生化特征 由表1、2可初步確定，BCK-1為顫螺菌屬，BCK-2為梭菌屬，BCK-3為芽孢鹽桿菌屬[14]。

2.2 優(yōu)勢(shì)菌種最適生長(zhǎng)條件 由圖1中各個(gè)曲線圖可知：BCK-1（顫螺菌屬）：最適pH7.4～7.6，最適溫度t=20℃，NaCl濃度為3%，百草枯濃度為1.6μL/mL；BCK-2（梭菌屬）：最適pH7.4～7.6，最適溫度t=28℃，NaCl濃度為3%～5%，百草枯濃度為2μL/mL；BCK-3（芽孢鹽桿菌屬）：最適pH6.9～7.1，最適溫度t=24℃，NaCl濃度為7%，百草枯濃度為2μL/mL。

2.3 優(yōu)勢(shì)菌株的降解率 由表3可知，3株優(yōu)勢(shì)降解菌降解百草枯的能力較好，降解率均在80%左右，其中BCK-3降解效果優(yōu)于其他2株菌。

3 結(jié)論與討論

本研究中，從濱州沾化長(zhǎng)期使用百草枯的土壤中富集、篩選分離出3株具有百草枯降解能力的菌株，并進(jìn)一步研究了這3株優(yōu)勢(shì)菌的生理生化特征及最佳生長(zhǎng)條件。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和生理生化指標(biāo)的測(cè)定，對(duì)這3株菌種進(jìn)行鑒定，初步確定：BCK-1為顫螺菌屬，BCK-2為梭菌屬，BCK-3為芽孢鹽桿菌屬。這3株菌株在37℃培養(yǎng)3d后，發(fā)現(xiàn)其在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)百草枯的降解率分別為79.35%、80.26%、86.22%?？赡苡捎谶@3株優(yōu)勢(shì)降解菌分離自黃河三角洲腹地的鹽堿地，具有較強(qiáng)的耐鹽能力[15]。因此，這3株優(yōu)勢(shì)菌種可應(yīng)用于受百草枯污染的菌源土壤的生物恢復(fù)。

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2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)勢(shì)菌的形態(tài)特征、生理生化特征 由表1、2可初步確定，BCK-1為顫螺菌屬，BCK-2為梭菌屬，BCK-3為芽孢鹽桿菌屬[14]。

2.2 優(yōu)勢(shì)菌種最適生長(zhǎng)條件 由圖1中各個(gè)曲線圖可知：BCK-1（顫螺菌屬）：最適pH7.4～7.6，最適溫度t=20℃，NaCl濃度為3%，百草枯濃度為1.6μL/mL；BCK-2（梭菌屬）：最適pH7.4～7.6，最適溫度t=28℃，NaCl濃度為3%～5%，百草枯濃度為2μL/mL；BCK-3（芽孢鹽桿菌屬）：最適pH6.9～7.1，最適溫度t=24℃，NaCl濃度為7%，百草枯濃度為2μL/mL。

2.3 優(yōu)勢(shì)菌株的降解率 由表3可知，3株優(yōu)勢(shì)降解菌降解百草枯的能力較好，降解率均在80%左右，其中BCK-3降解效果優(yōu)于其他2株菌。

3 結(jié)論與討論

本研究中，從濱州沾化長(zhǎng)期使用百草枯的土壤中富集、篩選分離出3株具有百草枯降解能力的菌株，并進(jìn)一步研究了這3株優(yōu)勢(shì)菌的生理生化特征及最佳生長(zhǎng)條件。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和生理生化指標(biāo)的測(cè)定，對(duì)這3株菌種進(jìn)行鑒定，初步確定：BCK-1為顫螺菌屬，BCK-2為梭菌屬，BCK-3為芽孢鹽桿菌屬。這3株菌株在37℃培養(yǎng)3d后，發(fā)現(xiàn)其在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)百草枯的降解率分別為79.35%、80.26%、86.22%?？赡苡捎谶@3株優(yōu)勢(shì)降解菌分離自黃河三角洲腹地的鹽堿地，具有較強(qiáng)的耐鹽能力[15]。因此，這3株優(yōu)勢(shì)菌種可應(yīng)用于受百草枯污染的菌源土壤的生物恢復(fù)。

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