頭孢丙烯片在健康受試者體內(nèi)的生物等效性研究

王詠梅　佟杰 曾永箎

【摘 要】目的：建立人血漿中頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體和頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體的高效液相測(cè)定法，并評(píng)價(jià)兩種制劑的人體生物等效性。方法：?jiǎn)蝿┛诜^孢丙烯片0.5g后，血樣經(jīng)處理后，進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果：頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體的線性范圍為0.1000～16.0000 ?g?mL-1，提取回收率為94.9%～96.0%；頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體的線性范圍為0.0200～1.6000 ?g?mL-1，提取回收率為92.7%～94.1%。人體中受試制劑和參比制劑的頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)為：Cmax為（7.93±1.87）和（7.82±1.76）?g?mL-1，Tmax為（1.75±0.67）和（1.81±0.61）h，t1/2為（1.35±0.15）和（1.32±0.16）h ，AUC0-t為（24.56±3.44）和（24.71±3.85） ?g?h?mL-1，；頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)為：Cmax為（0.70±0.15）和（0.68±0.16）?g?mL-1，Tmax為（1.72±0.52）和（1.77±0.62）h，t1/2為（1.20±0.28）和（1.24±0.21）h ，AUC0-t為（2.02±0.33）和（2.00±0.44） ?g?h?mL-1。結(jié)論：本方法靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，適用于臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究；兩制劑生物等效。

【關(guān)鍵詞】頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體；頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體；高效液相色譜法；生物等效性

【中圖分類號(hào)】R978.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004-7484（2014）05-2754-02

頭孢丙烯為第二代頭孢菌素類抗生素，具有廣譜抗菌作用[1]。本品的作用機(jī)制是抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，使細(xì)菌迅速破裂溶解。臨床用于治療敏感菌所致的輕、中度感染，包括上呼吸道感染，下呼吸道感染及皮膚和皮膚軟組織感染。頭孢丙烯中順式異構(gòu)體的含量在90 %以上，而反式異構(gòu)體只占10 %以下。順反式異構(gòu)體在化學(xué)穩(wěn)定性和抗GP（革蘭陽(yáng)性）鏈球菌和葡萄球菌活性方面是相同的，但在抗GN（革蘭陰性）大腸埃希桿菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌、淋病奈瑟菌和流感嗜血桿菌方面，順式頭孢丙烯的抗菌活性是反式頭孢丙稀的6～8倍。目前國(guó)內(nèi)尚無同時(shí)測(cè)定頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體和頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體含量并進(jìn)行生物等效性的報(bào)道。本文建立了高效液相色譜同時(shí)測(cè)定人血漿中頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體和頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體濃度的方法，用于頭孢丙烯在人體的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

1材料與方法

1.1 藥品與儀器

受試制劑（A藥）：規(guī)格：0.25 g/片，批號(hào)：091006，北京賽科藥業(yè)有限責(zé)任公司提供；參比制劑（R藥）：商品名：施復(fù)捷?，規(guī)格：0.25 g/片，批號(hào)：0905773，中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)。

頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體對(duì)照品（含量：92.7 %，批號(hào)：H01099）；頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體對(duì)照品（含量：89.5 %，批號(hào)：H05336），均由廠家提供；頭孢拉定對(duì)照品（含量：91.8 %，批號(hào)：130427-200306），購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈均為色譜純，三氯乙酸和二氯甲烷均為分析純；水為純凈水；空白血漿由吉林大學(xué)第一醫(yī)院提供。

LC-10ATvp高效液相色譜儀，配有LC solution Lite工作站（日本島津公司）；XW-80A旋渦混合器（上海滬西儀器廠有限公司）；TGL-16C高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；AUW120D分析天平（日本島津公司）；雷磁pHS-3E pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KS康式振蕩器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）。

1.2 受試對(duì)象

18名健康男性志愿者，年齡20～24歲，體重為54～70 kg，體重指數(shù)（BMI）為20～24（BMI=體重（Kg）/身高（m）的平方）。于試驗(yàn)前在醫(yī)院接受全面的體格及化驗(yàn)檢查，結(jié)果血、尿常規(guī)，肝、腎功能正常，心電圖正常，均符合受試者入選要求。試驗(yàn)前2周內(nèi)未服用任何藥物。受試者試驗(yàn)前均簽署知情同意書。試驗(yàn)方案經(jīng)吉林大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。臨床試驗(yàn)于吉林大學(xué)第一醫(yī)院進(jìn)行。

1.3 給藥方案與血樣采集

試驗(yàn)采用雙周期自身對(duì)照交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)。18例受試者隨機(jī)分成2組，每組9人。受試者試驗(yàn)日晨采集空白血樣后，空腹口服受試制劑2片或參比制劑2片以250 mL溫開水送服并做記錄。服藥后2 h可飲水，4 h進(jìn)統(tǒng)一清淡飲食。分別在給藥后的0.25、0.5、0.75、1.0、1.25，1.5、2、2.5、3、4、5、6、8小時(shí)由靜脈采血5 ml，置肝素化試管中，離心10min（3500 r·min-1），分離血漿，于-70℃冰箱中保存待測(cè)。

1.4 血藥濃度測(cè)定

1.4.1 色譜條件

色譜柱：依利特ODS（250×4.6 mm，5 μm）；預(yù)柱：C18 保護(hù)柱；流動(dòng)相：0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液（磷酸調(diào)pH值2.60 ± 0.05）-乙腈（85：15）；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：50 μl。

1.4.2 血漿樣品處理

精密量取血漿樣品500 μl，加入甲醇-水（1：1）100 μl，加入內(nèi)標(biāo)溶液（100.2000 μg/ml頭孢拉定）50 μl，20 %三氯醋酸100 μl，漩渦混合1分鐘，14000 rpm離心6分鐘，取上層液轉(zhuǎn)置于10 ml離心管中，依次加入乙腈0.5 ml和二氯甲烷2 ml，振蕩6分鐘，12000 rpm離心6分鐘，取上層液轉(zhuǎn)置于1.5 ml離心管中，14000 rpm離心6分鐘，取50 μl上清液進(jìn)樣分析。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取空白血漿500 μl，分別加入頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體和頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各50 μl，配制成血漿中頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體濃度為0.1000，0.3000，1.0000，2.0000，4.0000，8.0000，16.0000 μg/ml和頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體濃度為20.0，40.0，100.0，200.0，400.0，1000.0，1600.0 ng/ml的血漿樣品，按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下自“加入內(nèi)標(biāo)溶液（100.0000 μg/ml頭孢拉定）50 μl”起同法試驗(yàn)，每一濃度進(jìn)行雙樣本分析，制備頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體和頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)X，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值（AS/Ai）為縱坐標(biāo)Y，用加權(quán)最小二乘法[2]（權(quán)重系數(shù)：1/X2）進(jìn)行線性回歸運(yùn)算，求得的線性回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。結(jié)果表明，頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體在0.1000 ～ 16.0000 μg/ml范圍內(nèi)、頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體在20.0 ～ 1600.0 ng/ml范圍內(nèi)分別與待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物峰面積之比線性關(guān)系良好，濃度測(cè)定結(jié)果均達(dá)到試驗(yàn)要求的精密度與準(zhǔn)確度[3]。

1.4.4 精密度與準(zhǔn)確度

精密量取空白血漿500 μl，分別加入不同濃度的頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體和反式（E）異構(gòu)體質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μl，配制成血漿中頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體濃度為0.2000，1.6000和12.8000 μg/ml、頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體濃度為50.0，300.0和1280.0 ng/ml的血漿樣品（每濃度六樣本分析），按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下自“加入內(nèi)標(biāo)溶液（100.0000 μg/ml頭孢拉定）50 μl”起同法試驗(yàn)，連續(xù)測(cè)定三批（與標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定同時(shí)進(jìn)行），計(jì)算血漿樣品的濃度，求得方法的精密度與準(zhǔn)確度。結(jié)果表明，頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體和頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體的低、中、高3個(gè)濃度QC樣品的批內(nèi)、批間RSD均小于15%，符合有關(guān)的國(guó)際規(guī)范要求[3]。

1.4.5 提取回收率

精密量取空白血漿500 μl，分別加入不同濃度的頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體和反式（E）異構(gòu)體質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μl，配制成血漿中頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體濃度為0.2000，1.6000和12.8000 μg/ml，頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體濃度為50.0，300.0和1280.0 ng/ml的血漿樣品（每濃度六樣本分析），按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下自“加入內(nèi)標(biāo)溶液（100.2000 μg/ml頭孢拉定）50 μl”起同法試驗(yàn)，獲得相應(yīng)色譜峰面積；另取對(duì)應(yīng)濃度的頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體和頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液各50 μl，加入內(nèi)標(biāo)溶液（100.0000 μg/ml頭孢拉定溶液）50 μl，甲醇-水（1：1）600 μl（每濃度六樣本分析），渦旋混合30秒，取50 μl上清液進(jìn)樣分析，獲得相應(yīng)色譜峰面積（六次測(cè)定的平均值）。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計(jì)算提取回收率。結(jié)果表明，3種濃度下頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體的提取回收率分別為95.1%，94.9%和96.0%；頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體分別為92.9%，94.1%和92.7%，內(nèi)標(biāo)提取回收率為91.0，符合有關(guān)規(guī)定[3]。

1.4.6 血漿樣品的穩(wěn)定性

制備低、中、高3個(gè)濃度的血漿樣品各3份，共配制3組，分別進(jìn)行室溫、反復(fù)凍融及-70℃凍存條件下穩(wěn)定性試驗(yàn)。結(jié)果測(cè)定RSD均在15%以內(nèi)，表明頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體和頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體血漿樣品在室溫放置24 h、反復(fù)凍融3次及-70℃凍存條件下31天均穩(wěn)定性良好。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Phoenix WinNonlin 6.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件處理血藥濃度數(shù)據(jù)并進(jìn)行計(jì)算。Tmax和Cmax均為實(shí)測(cè)值，藥-時(shí)曲線下面積（AUC0-t）按梯形面積法計(jì)算。對(duì)Cmax、AUC的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換值及Tmax的實(shí)測(cè)值進(jìn)行方差分析、雙單側(cè)t檢驗(yàn)和90%置信區(qū)間估計(jì)，評(píng)價(jià)兩制劑的生物等效性。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

色譜圖結(jié)果表明，頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體保留時(shí)間為8.8分鐘左右，頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體的保留時(shí)間為13.8分鐘左右，頭孢拉定的保留時(shí)間為15.4分鐘左右，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體、反式（E）異構(gòu)體和內(nèi)標(biāo)物頭孢拉定的測(cè)定（A為頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體，B為頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體，C為頭孢拉定）。因此本方法具有良好的專屬性，符合測(cè)定要求。結(jié)果見圖1。

異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)的樣品色譜圖

（峰A為頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體；峰B 為羅頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體；峰C為頭孢拉定（內(nèi)標(biāo)））

（峰A為頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體；峰B 為羅頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體；峰C為頭孢拉定（內(nèi)標(biāo)））

2.2 血藥濃度-時(shí)間曲線

18名健康受試者單劑量口服頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體受試制劑和參比制劑后，平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。

2.3 血藥濃度及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

18名受試者單劑量口服受試制劑和參比制劑后頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體和頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1。

2.4 生物等效性評(píng)價(jià)

以AUC0-t計(jì)算，頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體和頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體的相對(duì)生物利用度分別為102.2 % ± 13.7 %和103.5 % ± 15.2。對(duì)頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體和頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析，并進(jìn)一步采用雙單側(cè) t 檢驗(yàn)進(jìn)行生物等效性評(píng)價(jià)。頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體AUC0-t和AUC0-∞的90%置信區(qū)間為100.3%～110.7%和100.4%～110.6%；Cmax的90%置信區(qū)間為98.3%～112.8%和94.6%～103.9% ，Tmax在受試制劑與參比制劑間無顯著性差異。頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體的AUC0-t和AUC0-∞的90%置信區(qū)間為94.5%～103.6%和94.5%～103.7%，Cmax的90%置信區(qū)間為98.3%～112.8%和94.6%～103.9%，Tmax在受試制劑與參比制劑間無顯著性差異。

3 討論

血漿樣品處理時(shí)，如果不用乙腈和二氯甲烷除雜，色譜圖上待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)處會(huì)有雜質(zhì)峰的干擾。本法提取回收率較高，且方法的重現(xiàn)性較好。與有關(guān)文獻(xiàn)比較[4]，該法靈敏度高且選擇性好，完全可以滿足臨床藥代動(dòng)力學(xué)的要求。

采用HPLC法研究頭孢丙烯片在健康志愿者體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過程。結(jié)果表明，18名健康男性志愿者分別口服0.5g頭孢丙烯片受試制劑與參比制劑后，兩制劑的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（Cmax，AUC）經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，方差分析結(jié)果表明頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體和頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體在兩種制劑間、周期間無顯著性差異（P>0.05），個(gè)體間有顯著性差異（P<0.05），說明兩藥物在人體內(nèi)的吸收分布過程基本相似；經(jīng)雙單側(cè)t檢驗(yàn)和[1-2α] 置信區(qū)間分析，頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體和頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體受試制劑的AUC0-t和AUC0-∞的90%置信區(qū)間在參比制劑相應(yīng)參數(shù)的80%～125%內(nèi)，表明頭孢丙烯順式（Z）異構(gòu)體和頭孢丙烯反式（E）異構(gòu)體受試制劑與參比制劑具有生物等效性。

在臨床試驗(yàn)過程中，醫(yī)生對(duì)受試者進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)護(hù)，未觀察到臨床不良反應(yīng)現(xiàn)象；受試者在試驗(yàn)后進(jìn)行體檢，檢測(cè)指標(biāo)有超出正常值范圍者，經(jīng)臨床醫(yī)生判斷無臨床意義。

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