胞質(zhì)內(nèi)單精子注射制備轉(zhuǎn)基因豬技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與前景

胡驍睿　朱志偉　黃菁等

摘要 綜述了20多年來(lái)轉(zhuǎn)基因豬的研究概況，探討了各種轉(zhuǎn)基因技術(shù)的特點(diǎn)，分析了胞質(zhì)內(nèi)單精子注射制備轉(zhuǎn)基因豬技術(shù)的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，并展望了單精子注射與人工染色體載體技術(shù)相結(jié)合制備大片段轉(zhuǎn)基因豬的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 轉(zhuǎn)基因；單精注射；人工染色體；豬胚胎

中圖分類(lèi)號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）08-02337-03

The Advantages and Prospect of Producing Transgenic Porcine by Intracytoplasmic Sperm Injection

HU Xiaorui， PAN Jianzhi et al

（Zhejiang Normal University， Jinhua， Zhejiang 321004； Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Zhejiang Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou， Zhejiang 310021）

Abstract The review was about the development of transgenic porcine in the last two decades. And the characteristics of different kinds of transgenic methods are discussed. This paper expounds the advantages of Intracytoplasmic Sperm Injection（ICSI） in producing transgenic porcine， and describes the application of producing large fragments of transgenic pigs by ICSI combined with artificial chromosome vectors technology.

Key words Transfer genes； ICSI； Artificial chromosome vectors； Pig embryo

豬的轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究具有重要的理論和商業(yè)價(jià)值[1]。利用豬的轉(zhuǎn)基因技術(shù)能在較短時(shí)間內(nèi)提高豬的生產(chǎn)性能和抗病能力，加快動(dòng)物改良進(jìn)程，培育出新的品種或種群；可用于研究未知基因的功能和關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)；也可作為生物反應(yīng)器，還可為人異種器官移植提供供體等[2]。從技術(shù)角度來(lái)看，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)基因胚胎是制作轉(zhuǎn)基因豬的基礎(chǔ)，因?yàn)橥庠椿驅(qū)氲妮d體或途徑不同，形成了各具特色和功效的轉(zhuǎn)基因技術(shù)[3]。其中，以精子為載體的方法統(tǒng)稱(chēng)為精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Spermmediated gene Transfer，SMGT），受精過(guò)程的控制對(duì)于精子能否將外源基因攜帶進(jìn)入成熟卵子，進(jìn)而整合至受精卵基因組，是決定制備轉(zhuǎn)基因胚胎成敗的關(guān)鍵。筆者對(duì)卵細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）技術(shù)在豬轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用進(jìn)行了分析，以加深對(duì)這種轉(zhuǎn)基因方法的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景的了解。

1 轉(zhuǎn)基因豬研究概況

豬既是重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，也是人類(lèi)醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)重要模型動(dòng)物，因?yàn)閺淖匀惶匦詠?lái)看，其在解剖、組織、生理和營(yíng)養(yǎng)代謝等方面與人類(lèi)略接近。因此，無(wú)論從農(nóng)業(yè)科技的角度還是人類(lèi)醫(yī)療、基礎(chǔ)研究等方面，各國(guó)學(xué)者對(duì)轉(zhuǎn)基因豬的研究均極為重視。自1985年Hammer等得到第1批轉(zhuǎn)基因豬以來(lái)，有關(guān)轉(zhuǎn)基因豬的研究已有20多年的歷史。對(duì)豬生產(chǎn)性能的遺傳改良、作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)醫(yī)用蛋白以及作為異種器官移植的供體等方面都取得了一系列重要的進(jìn)展。

在國(guó)外，Lo等[4]將小鼠抗磷酰膽堿（PC）抗體的α+κ鏈融合基因注入豬的受精卵，獲得的轉(zhuǎn)基因豬中產(chǎn)生的單克隆抗體已被證實(shí)具有抗病活性。Brem等將小鼠抗流感基因?qū)胴i的基因組，得到的轉(zhuǎn)基因豬增強(qiáng)了對(duì)流感病毒的抵抗力。日本近畿大學(xué)入谷明教授等將菠菜 FAD12基因植入豬的受精卵中，成功培育出比普通豬不飽和脂肪酸含量高20%的轉(zhuǎn)基因豬。Lai等[5]將取自秀麗線(xiàn)蟲(chóng)的FAT1基因?qū)胴i的基因組，然后借助克隆技術(shù)培育出富含ω3脂肪酸的轉(zhuǎn)基因豬。美國(guó)弗吉尼亞大學(xué)Willam等[6]成功構(gòu)建了在乳腺中特異表達(dá)人蛋白C的轉(zhuǎn)基因豬，其表達(dá)量是正常人血中含量的200倍。Paleyanda等將人凝血因子Ⅷ基因與乳腺表達(dá)載體相連接并導(dǎo)入豬，得到了在豬乳中表達(dá)人凝血因子Ⅷ的轉(zhuǎn)基因豬。Rosengard 等[7]將人DAF（促衰變因子）基因?qū)胴i的基因組并得到表達(dá)，用這種轉(zhuǎn)基因豬的心臟移植給狒狒，成功克服了異種器官移植的超急性排斥反應(yīng)。

在國(guó)內(nèi)的研究始于20世紀(jì)80年代后期的國(guó)家“863”計(jì)劃，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)陳永福教授與湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所魏慶信等人合作，1990年得到國(guó)內(nèi)第1批轉(zhuǎn)OMTPGH基因豬[8]。2000年，魏慶信等[9]報(bào)道hDAF轉(zhuǎn)基因豬的制備獲得成功。我國(guó)湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭新民等成功構(gòu)建轉(zhuǎn)人血清白蛋白基因豬，其血液中表達(dá)量高達(dá) 20 g/L 。賴(lài)良學(xué)博士[10]在美國(guó)密蘇里大學(xué)與其他研究人員應(yīng)用豬胚胎成纖維細(xì)胞系進(jìn)行基因打靶，獲得了敲除部分αGT（半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶）基因的克隆豬。特別是近年來(lái)，包括筆者所在實(shí)驗(yàn)室在內(nèi)的一批研究機(jī)構(gòu)成功構(gòu)建多種轉(zhuǎn)基因豬或基因敲除豬。

2 豬轉(zhuǎn)基因常用方法的技術(shù)特點(diǎn)

目前，成功使用并獲得轉(zhuǎn)基因豬的方法主要有原核顯微注射法、核移植轉(zhuǎn)基因法、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法、精子載體法等。

2.1 原核顯微注射法

受精卵原核注射法是最早應(yīng)用于家畜的轉(zhuǎn)基因方法[11]，最早建立的轉(zhuǎn)基因豬技術(shù)是參照小鼠的原核注射法，該技術(shù)就是使用精細(xì)的顯微注射針將外源基因直接注入豬受精卵的雄原核， 使外源基因整合到基因組， 從而獲得轉(zhuǎn)基因豬。用該方法制備轉(zhuǎn)基因豬的優(yōu)點(diǎn)是可以將較大片段的重組DNA注射到原核，獲得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能夠有效地表達(dá)，其缺點(diǎn)是成本較高，轉(zhuǎn)基因效率低，技術(shù)方面要求較高，注射的DNA整合到宿主基因組的效率低，得到轉(zhuǎn)基因子代往往是嵌合體，需要花費(fèi)大量的費(fèi)用和時(shí)間篩選轉(zhuǎn)基因個(gè)體，而且豬的受精卵含有大量的脂肪顆粒，在顯微鏡下較難看清原核。

2.2 體細(xì)胞核移植克隆法

體細(xì)胞核移植克隆法是目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用最廣泛的方法，該技術(shù)是先將外源基因整合到供體細(xì)胞中，然后將供體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去核卵母細(xì)胞，組成重構(gòu)胚胎，再將其移植到假孕母體，待其妊娠、分娩后即可得到轉(zhuǎn)基因的克隆豬。雖然該技術(shù)既能借助各種基因轉(zhuǎn)染手段制備轉(zhuǎn)基因個(gè)體，也能借助靶向基因敲除技術(shù)獲得基因敲除動(dòng)物，但具有重組胚胎移植產(chǎn)仔率低、后代表型異常多發(fā)、制備成本高等缺點(diǎn)，篩選基因修飾細(xì)胞需要借助藥物基因標(biāo)記，難以達(dá)到無(wú)選擇標(biāo)記的基因轉(zhuǎn)化，利用電轉(zhuǎn)染或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染大片段DNA時(shí)往往只有部分序列嵌合至基因組，因此也不適合大片段轉(zhuǎn)基因。

2.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒法

逆轉(zhuǎn)錄病毒法的基本過(guò)程為：將目的基因重組到反轉(zhuǎn)錄病毒RNA 載體上，制成高滴度的病毒顆粒，人為感染著床前或著床后的胚胎，也可使胚胎與能釋放反轉(zhuǎn)錄病毒的單培養(yǎng)層細(xì)胞共孵育以達(dá)到感染的目的。反轉(zhuǎn)錄病毒RNA 進(jìn)入寄主細(xì)胞后，被反轉(zhuǎn)錄為DNA，并在整合酶和其末端特殊核酸序列作用下整合到寄主細(xì)胞的基因組進(jìn)行表達(dá)和遺傳，得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。逆轉(zhuǎn)錄病毒法雖然操作簡(jiǎn)單，能有效將目的基因以單拷貝形式插入宿主，而且基因轉(zhuǎn)移的效率較高，但基因插入是隨機(jī)的，并且攜帶的DNA片段大小受限制，產(chǎn)生的后代大多為嵌合體，不容易建立ES細(xì)胞系。

2.4 精子載體法

精子載體法被認(rèn)為是最簡(jiǎn)便的轉(zhuǎn)基因方法。該方法只需將處理好的精子和外源DNA 共同孵育后，然后通過(guò)體外受精、人工授精轉(zhuǎn)染到胚胎中，從而得到轉(zhuǎn)基因豬個(gè)體。相關(guān)研究已有一些成功報(bào)道[12]，但其結(jié)果往往是外源基因只在PCR中被檢測(cè)到，推測(cè)外源基因已被分解為不完整的片斷。另外，從原理上分析，由于存在透明帶、細(xì)胞膜等自然屏障，卵子允許精子帶入不經(jīng)降解的外源DNA的可能性極低。精子載體法由于試驗(yàn)結(jié)果難以重復(fù)，未能成為公認(rèn)的可行途徑。此外，體外人工授精生產(chǎn)豬體外胚胎的技術(shù)系統(tǒng)還有待完善，其中主要因素之一是多精受精的高發(fā)，由此降低了體外胚胎的發(fā)育率和移植受胎率。

3 單精子注射轉(zhuǎn)基因法的特色優(yōu)勢(shì)

卵細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射技術(shù)是20世紀(jì)80年代后期發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新型人工輔助生殖技術(shù)，是借助顯微操作系統(tǒng)，將單一精子注入成熟卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)使其受精的技術(shù)，能使任意單一精子不經(jīng)自然選擇而完成受精。由于ICSI繞過(guò)了正常受精的所有過(guò)程，避開(kāi)了自然受精過(guò)程中卵丘顆粒細(xì)胞，透明質(zhì)酸細(xì)胞外基質(zhì)（放射冠）和穿透卵透明帶這三大屏障對(duì)精子的篩選作用，使ICSI具有受精率高和多精受精率低等優(yōu)點(diǎn)[13-15] 。迄今為止，該項(xiàng)技術(shù)已在兔、牛、小鼠、馬、猴、豬等動(dòng)物和人類(lèi)上獲得成功[16]。由于ICSI法具有受精率高和多精受精率低，其受精率不受精子濃度、形態(tài)和活力的影響，在受精機(jī)理的研究、野生動(dòng)物遺傳資源保護(hù)、種質(zhì)資源引進(jìn)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

利用ICSI技術(shù)將攜帶外源基因DNA的精子導(dǎo)入卵母細(xì)胞，是單精子注射法轉(zhuǎn)基因（ICSISMGT）的基本原理。ICSISMGT法廣義上也可稱(chēng)為精子載體法的一種，但其受精通過(guò)人為的精子注射完成，避開(kāi)了自然受精的保護(hù)屏障，因而具有傳統(tǒng)的精子載體轉(zhuǎn)基因方法所無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。①對(duì)外源基因片段的長(zhǎng)度限制少，不僅可以導(dǎo)入小片段DNA（<5 kb）而且還可以導(dǎo)入大片段DNA（11.9～170 kb）甚至細(xì)菌或人造染色體（BAC或MAC）[13-14，17-19]，適用范圍與受精卵原核注射法相似，但顯微注射法的難度低、效率更高；②單精子受精的精子不需要具有外部結(jié)構(gòu)的完整性和運(yùn)動(dòng)能力，可通過(guò)各種理化處理促進(jìn)與外源基因DNA的結(jié)合，提高基因?qū)胄?；③精子和DNA的復(fù)合體直接輸入卵細(xì)胞，不需要體外受精的孵育過(guò)程，排除了透明帶和卵質(zhì)膜對(duì)精子入卵的阻礙作用，外源基因受損的幾率大大降低，有利于導(dǎo)入基因保持完整性；④基本排除多精入卵的可能性，受精率和胚胎正常發(fā)育率高，大大節(jié)約準(zhǔn)備成熟豬卵母細(xì)胞核精子所付出的時(shí)間和成本。

將精子載體轉(zhuǎn)基因法（SMGT）與單精注射（ICSI）結(jié)合制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是一種新的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，研究歷史較短，但其可行性和高效性已在多個(gè)物種中得到證實(shí)。1999年ICSI技術(shù)被首次應(yīng)用于小鼠轉(zhuǎn)基因[20]。2004年日本KOTO等[21]成功獲得ICSI轉(zhuǎn)基因大鼠。作為一種新型的動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，利用ICSI生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在國(guó)際上獲得了巨大成功，不僅可以獲得整合小片段外源DNA的小鼠和大鼠，而且還可以生產(chǎn)分子量高達(dá)250 kb的細(xì)菌人工染色體（BAC）等人工染色體的轉(zhuǎn)基因小鼠。2011年LIU等[22]將ICSI技術(shù)應(yīng)用于青鳉魚(yú)的轉(zhuǎn)基因并獲得了成功。

豬的ICSI研究起步較晚。Hosoi等[23]最早將豬活精子注入豬卵母細(xì)胞的包漿內(nèi)觀察到原核形成。Kim等[24]分別將豬的精子和精子頭注入體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞內(nèi)獲得囊胚。2000年，Koo等[25]將精子與外源基因共孵育后通過(guò)ICSI注入豬體外成熟卵母細(xì)胞中獲得轉(zhuǎn)基因嵌合囊胚。Martin[26]采用體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞經(jīng)ICSI首次獲得存活的小豬。2003年，Michiko等[27]報(bào)道了體外成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞經(jīng)ICSI獲得3頭健康小豬。2006年Kurome等[28]將精子與攜帶有人白蛋白（hALB）和綠色熒光蛋白（GFP）基因序列的DNA片段共孵育，用ICSI技術(shù)生產(chǎn)出1頭表達(dá)hALB和GFP的轉(zhuǎn)基因仔豬。2007年又通過(guò)對(duì)精子-外源基因DNA復(fù)合體制備方法進(jìn)行改進(jìn)，使ICSI法轉(zhuǎn)基因胚胎的囊胚發(fā)育率、外源基因EGFP的表達(dá)陽(yáng)性率大幅度提高，7頭胚胎移植產(chǎn)仔中轉(zhuǎn)基因個(gè)體有2頭[29]。由此可見(jiàn)，ICSI顯微技術(shù)與精子載體技術(shù)相結(jié)合為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物開(kāi)辟了一條簡(jiǎn)單易行的技術(shù)路線(xiàn)。

4 ICSI介導(dǎo)豬轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用與展望

盡管家豬轉(zhuǎn)基因技術(shù)已取得了較大進(jìn)步，多種轉(zhuǎn)基因豬表現(xiàn)出良好的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景，但豬的轉(zhuǎn)基因育種等應(yīng)用研究還存在著諸多制約因素。例如，對(duì)家畜基因組的結(jié)構(gòu)、功能和表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究尚不夠深入，可選擇利用的功效基因資源缺乏；轉(zhuǎn)基因家畜生產(chǎn)效率低、成本高、周期長(zhǎng)、通過(guò)大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來(lái)篩選優(yōu)良家系的花費(fèi)巨大；外源基因的體內(nèi)表達(dá)很難控制，容易偏離正常調(diào)控而喪失功能，或擾亂動(dòng)物機(jī)體的生理平衡；對(duì)單個(gè)基因進(jìn)行遺傳操作，難以獲得由多基因控制的數(shù)量性狀的改良；人們對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生物安全存在疑慮。這些問(wèn)題的解決首先需要依靠功能基因組學(xué)基礎(chǔ)研究的深入，更需要轉(zhuǎn)基因技術(shù)本身的進(jìn)步和成熟。

大片段轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因技術(shù)研發(fā)和轉(zhuǎn)基因育種應(yīng)用研究中具有重要的意義。只有能夠?qū)氪笃瓮庠椿?，才有可能改變目前轉(zhuǎn)基因主要是cDNA而非基因組中自然序列的現(xiàn)狀，也有希望通過(guò)附加更多基因上游或下游序列，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的精細(xì)、有效調(diào)控。因此，高效率導(dǎo)入大片段DNA的轉(zhuǎn)基因是近年來(lái)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究的一個(gè)重要方向。人工染色體（Artificial chromosome）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因是大片段轉(zhuǎn)基因的典型例子，其為動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)展現(xiàn)了一個(gè)新的平臺(tái)。

人工染色體是指人工構(gòu)建的含有天然染色體基本功能單位的載體系統(tǒng)，包括酵母人工染色體（YAC）、細(xì)菌人工染色體（BAC）、P1派生人工染色體（PAC）和哺乳動(dòng)物人工染色體（MAC）等，通常用于基因組圖譜制作、基因分離以及基因組序列分析的工具。以細(xì)菌人工染色體（BACs）為例，BAC載體可以在1個(gè)單一克隆中包含完整的基因座位，包括編碼區(qū)、內(nèi)含子和調(diào)控區(qū)，而且具有克隆DNA能穩(wěn)定復(fù)制、易分離、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。

以BAC作為轉(zhuǎn)基因載體，由于BAC攜帶的基因包括上下游調(diào)控序列，可以與轉(zhuǎn)錄酶、轉(zhuǎn)錄因子等作用，轉(zhuǎn)基因?qū)⒛茏袷鼗蚬逃械谋磉_(dá)機(jī)制[30-31]。另外，導(dǎo)入的外源序列在受體基因組中營(yíng)造一種相對(duì)獨(dú)立的環(huán)境，消除或減少染色體位置效應(yīng)的影響，可以最大程度地保持基因本身的表達(dá)時(shí)空調(diào)控特征。因此，利用BAC轉(zhuǎn)基因已經(jīng)成為小鼠上對(duì)候選基因直接進(jìn)行功能研究的有力手段。同時(shí)，在動(dòng)物生物反應(yīng)器研制中，利用BAC轉(zhuǎn)基因較采用短片段的組織特異性啟動(dòng)子更容易實(shí)現(xiàn)外源基因在特定部位的高水平表達(dá)。1999年Stinnakre等[32]將克隆有山羊α乳清蛋白及其兩側(cè)非編碼區(qū)的BAC DNA片段顯微注射到小鼠受精卵原核，獲得了高濃度乳腺特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠。此外，目前的BAC載體可以通過(guò)α互補(bǔ)原理替換內(nèi)含基因的蛋白編碼序列，用來(lái)表達(dá)其他目的基因。依靠載體骨架兩端的稀少型限制酶切位點(diǎn)（例如NotⅠ），可以將基因表達(dá)單元的長(zhǎng)片段克隆DNA回收用于轉(zhuǎn)基因，因而能夠避免載體中附帶的藥物篩選基因等序列進(jìn)入動(dòng)物基因組。

小鼠BAC轉(zhuǎn)染主要利用受精卵原核注射方法，而豬受精卵內(nèi)分布大量脂滴，造成原核可視性極差，難以采用原核注射法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，使大片段DNA的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)缺乏有效技術(shù)手段，而ICSI介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因有望解決豬轉(zhuǎn)基因的難題。2012年日本明治大學(xué)長(zhǎng)嶋教授研究組[33]利用ICSI方法進(jìn)行豬BAC轉(zhuǎn)基因研究獲得成功，開(kāi)創(chuàng)了國(guó)際上豬ICSIBAC轉(zhuǎn)基因的先例。ICSI技術(shù)與BAC轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合制備轉(zhuǎn)基因豬，為今后制備大片段轉(zhuǎn)基因豬提供了新方法，相信該技術(shù)必定會(huì)受到越來(lái)越多的關(guān)注，并被廣泛研究與應(yīng)用，成為今后轉(zhuǎn)基因豬研究的優(yōu)選技術(shù)途徑。

42卷8期 胡驍睿等 胞質(zhì)內(nèi)單精子注射制備轉(zhuǎn)基因豬技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與前景

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