兔耳廓軟骨的體外培養(yǎng)及細(xì)胞特性研究

謝波 馮娟娟 馬夢(mèng)婷等

摘要 [目的]研究軟骨發(fā)育與重建，建立軟骨體外培養(yǎng)模式，[方法]通過改良組織塊細(xì)胞培養(yǎng)法，進(jìn)行家兔耳廓彈性軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)，研究其形態(tài)與生長特性。[結(jié)果]兔耳軟骨組織16 h完成貼壁，1.5 d軟骨細(xì)胞遷出，144 h細(xì)胞生長達(dá)到融合；傳代兔耳軟骨細(xì)胞12 h貼壁，生長特性與原代相似，但第3代細(xì)胞的延滯期長，在培養(yǎng)48 h開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)第8天細(xì)胞數(shù)量達(dá)到峰值。HE染色結(jié)果表明彈性軟骨細(xì)胞形態(tài)均勻，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，核呈橢圓形，可見雙核或多核現(xiàn)象。軟骨陷窩和核深染，胞漿著色均勻。細(xì)胞分裂旺盛。同族細(xì)胞群清晰。[結(jié)論]原代及2代耳軟骨細(xì)胞體外生長特性及細(xì)胞形態(tài)一致，培養(yǎng)條件穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞 彈性軟骨；改良組織塊法；體外培養(yǎng)；細(xì)胞特性

中圖分類號(hào) S829.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）08-02323-03

Culture in vitro of Rabbit Auricular Cartilage and Its Cell Characteristics

XIE Bo， GAO Qinghua， WANG Shanshan，et al （College of Animal Science， Tarim University， Alar， Xinjiang 843300； College of Life Sciences， Tarim University， Alar， Xinjiang 843300）

Abstract [Objective] The research aimed to study the development and reconstruction of cartilage and establish in vitro cultivation mode of cartilage. [Method] The elastic cartilage cells of rabbit auricle were cultured in vitro by using modified tissue block cell culture method. And their morphological and growth characteristics were studied. [Result] The cartilage tissue of rabbit auricle adhered to wall within 16 h and cartilage cells fell off after 1.5 d， the cells grew and fused after 144 h. The generated cartilage cells of rabbit auricle adhered to wall within 12 h and their growth characteristics were similar with the primary generation. The third generation of cells had a long lag phase， entered into the logarithmic phase after culturing 48 h and the cell number reached the peak value on the eighth day. HE staining results showed that the configuration of elastic cartilage cells was uniformed， the cells were round or oval and their cores were elliptical. Dual-core or multi-core phenomena were seen. The cartilage lacuna and nuclear were stained， and the staining of cytoplasm was uniformed. Cell division was very vigorous. The same family of cell populations was clearly seen. [Conclusion] The primary and two generations of rabbit auricle cartilage cells had consistent growth characteristics and cell morphology and stable culture conditions.

Key words Elastic cartilage； Modified tissue block； Culture in vitro； Cell characteristics

彈性軟骨僅存在高等動(dòng)物外耳廓、聽道、會(huì)咽等處。與其他軟骨相比，間質(zhì)中含有大量交織成網(wǎng)的彈性纖維，成網(wǎng)狀在軟骨內(nèi)排列，同時(shí)含少量膠原纖維。目前，彈性軟骨大多被用于修復(fù)人類殘缺及畸形耳廓及其他美容修復(fù)[1]。另外，還被用于透明軟骨的修復(fù)。MATEV GORENEK等[2]以兔耳軟骨為材料，成功體外培養(yǎng)后移植到兔腰椎間盤，研究自體軟骨移植方式對(duì)人類腰椎間盤進(jìn)行性退化的治療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用耳彈性軟骨移植至6周后在髓核處有類透明軟骨組織產(chǎn)生，而在腰椎間盤處的軟骨基質(zhì)中未發(fā)現(xiàn)彈性軟骨的細(xì)胞。Mizuno M等[3]用同樣的方法用將狗的耳彈性軟骨移植到其受傷的膝關(guān)節(jié)處，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植的彈性軟骨細(xì)胞能夠重塑透明軟骨，為人類關(guān)節(jié)進(jìn)行性退化疾病找到很好的解決方法。由此可見，彈性軟骨對(duì)關(guān)節(jié)透明軟骨的重建和修復(fù)有重要意義。

目前我國對(duì)彈性軟骨的體外培養(yǎng)開始于2000年。張金寧等體外培養(yǎng)了獼猴耳軟骨，并分析了體外環(huán)境下軟骨細(xì)胞的代謝功能。溫葉飛[4]、常慶[5]、蔣欣泉[6]和謝波[7]分別利用豬、羊和兔的耳廓軟骨進(jìn)行體外培養(yǎng)。冉鵬[8]對(duì)人耳廓軟骨進(jìn)行了體外培養(yǎng)，認(rèn)為體外培養(yǎng)的人耳軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性不依賴年齡，體外培養(yǎng)的第1代和第2代人耳軟骨細(xì)胞可作為耳軟骨組織工程研究的種子細(xì)胞。

基于此，筆者利用兔耳廓軟骨作為材料，通過體外培養(yǎng)觀察彈性軟骨細(xì)胞在離體情況下的生長狀態(tài)及特性，確定生長條件，以期為彈性軟骨體外工程組織研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 2月齡健康雌性家兔。

1.2 試劑與儀器 胎牛血清FBS（Sigma）；細(xì)胞培養(yǎng)液LDMEM；透明質(zhì)酸酶（Sigma）；Ⅱ型膠原酶（Sigma）；胰蛋白酶（Sigma）；噻唑藍(lán)MTT；青霉素鈉；硫酸鏈霉素；CO2加濕培養(yǎng)箱（MCO15A）；倒置相差顯微鏡（Nikon）；離心機(jī)（Sigma）；生物顯微鏡（舜宇）；酶標(biāo)儀（Biotek）；血細(xì)胞計(jì)數(shù)器；無菌操作臺(tái)。

1.3 方法

1.3.1 取樣與處理。耳緣靜脈注射鹽酸普魯卡因，麻醉家兔，剪掉兔耳邊緣的兔毛，用5%碘酊的消毒，酒精棉脫碘，隨后使用滅菌手術(shù)剪快速剪取1 cm×1 cm大小的兔耳組織，立即置于1 000 IU/ml的雙抗（青霉素鈉與硫酸鏈霉素）DHanks液中浸泡5 min。轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)內(nèi)操作，修剪皮膚邊緣，用含400 IU/ml的雙抗DHanks沖洗3～5遍，在200 IU/ml雙抗的DHanks液中使用無菌眼科鑷將軟骨與表皮充分剝離。

1.3.2 原代培養(yǎng)。處理后軟骨組織剪碎為1 mm×1 mm×1 mm的組織塊后，轉(zhuǎn)移至15 ml的離心管，加入DHanks液反復(fù)吹打，漂洗2～3次，用DMEM工作液配制的0.1%透明質(zhì)酸酶在培養(yǎng)箱中37 ℃消化30 min，棄去透明質(zhì)酸酶，加入DHanks配制的0.25%的胰蛋白酶37 ℃下消化1 h，離心棄胰蛋白酶用DHanks漂洗，加入用含5%血清的DMEM配制的Ⅱ型膠原酶，37 ℃下消化6 h，移除上清液，加入5 ml的DHanks液反復(fù)吹打，漂洗2～3次，移除上清，將組織塊均勻的分布于培養(yǎng)瓶底部，然后將培養(yǎng)瓶底部傾斜，沿斜面加入5 ml 15% 胎牛血清（FBS）100 IU/ml雙抗的DMEM培養(yǎng)液，底面向上倒置放入38.5 ℃、5% CO2加濕培養(yǎng)箱中，待組織塊貼壁后輕輕反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，在38.5 ℃、5% CO2加濕培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。此后，根據(jù)細(xì)胞生長狀況，每隔48～72 h換液1次，直至組織塊邊緣游離出的細(xì)胞已經(jīng)完全包圍組織塊，將培養(yǎng)瓶內(nèi)的組織塊取出，在新的滅菌培養(yǎng)瓶內(nèi)按照相同的方法繼續(xù)培養(yǎng)組織塊。每日觀察并記錄軟骨細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)目、生長、分裂和增殖等狀況。

1.3.3 細(xì)胞傳代培養(yǎng)。生長融合的細(xì)胞可進(jìn)行傳代，用DHanks液清洗貼壁細(xì)胞3次，從培養(yǎng)瓶側(cè)面緩緩加入0.25%胰蛋白酶消化3～5 min，待細(xì)胞變圓變亮、將脫壁時(shí)，加入完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打使細(xì)胞脫落，將收集消化下的細(xì)胞置于10 ml離心管內(nèi)，800 r/min離心5 min。棄上清，調(diào)整密度，以1×105個(gè)/ml接種到含15%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，吸管吹打混勻，以5 ml的接種量接入培養(yǎng)瓶，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h以后完全換液，除去未貼壁細(xì)胞，以后每72 h半量換液。

1.3.4 細(xì)胞形態(tài)觀察。在倒置顯微鏡下觀察不同代數(shù)、不同時(shí)期細(xì)胞的形態(tài)。取原代細(xì)胞爬片HE染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.5 生長曲線的繪制。10%FBS的DMEM培養(yǎng)液吹打“1.2.2”中離心到的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸浮液，用臺(tái)盼藍(lán)染色調(diào)整細(xì)胞濃度到1×105個(gè)/ml，以100 μl的接種量接入96孔培養(yǎng)板的孔內(nèi)，同時(shí)設(shè)立不含細(xì)胞的培養(yǎng)基做空白對(duì)照孔，次日在每個(gè)孔內(nèi)補(bǔ)液100 μl；24 h以后每天隨機(jī)抽取3個(gè)孔，每個(gè)孔分別加入20 μl MTT溶液，此后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再將孔內(nèi)液體吸出棄掉，再加入80 μl DMSO，吹打至沉淀完全溶解后，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于波長490 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算平均值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以平均吸光度為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 原代培養(yǎng) 從圖1可以看出，處理組織塊24 h后完全貼壁，貼壁的組織塊邊緣模糊不清。貼壁后的組織塊原代培養(yǎng)24 h倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)組織塊邊緣遷出少量的軟骨細(xì)胞，細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞核不可見，細(xì)胞輪廓清晰。貼壁后培養(yǎng)72 h后，大量的軟骨細(xì)胞從組織塊中遷出，呈規(guī)律的放射狀排列，細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞的透過性增強(qiáng)。此后細(xì)胞不斷增殖，在組織塊貼壁120 h后細(xì)胞數(shù)量達(dá)到高峰，細(xì)胞排列緊密，呈菊花瓣?duì)钆帕虚_，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，且細(xì)胞遮光性增強(qiáng)。

2.2 細(xì)胞爬片HE染色 從圖2可以看出，HE染色的彈性軟骨細(xì)胞形態(tài)均勻，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，核呈橢圓形，可見雙核或多核現(xiàn)象。軟骨陷窩和核深染，胞漿著色均勻。細(xì)胞分裂旺盛。同族細(xì)胞群清晰可見。

2.3 生長曲線 從圖3可以看出，體外培養(yǎng)耳彈性軟骨細(xì)胞，原代細(xì)胞與1代細(xì)胞均在培養(yǎng)144 h細(xì)胞數(shù)量達(dá)到峰值。第3代細(xì)胞的延滯期長，在培養(yǎng)48 h開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)到192 h（第8天）細(xì)胞數(shù)量達(dá)到峰值。

3 討論

原代細(xì)胞及第1代細(xì)胞的生長曲線一致，細(xì)胞生長能力旺盛。該試驗(yàn)結(jié)果與溫葉飛[4]用豬耳軟骨為材料體外培養(yǎng)的結(jié)果相一致，而與獼猴耳軟骨細(xì)胞的生長特性有所差異，細(xì)胞倍增時(shí)間比獼猴耳軟骨細(xì)胞早24 h。兔耳第3代細(xì)胞的生長能力開始下降。潛伏期增長這一結(jié)果與豬耳軟骨細(xì)胞不同，豬耳軟骨的第6代細(xì)胞生長開始變慢。細(xì)胞體外條

件下生長受多個(gè)因素（如溫度、滲透壓、有害物質(zhì)或細(xì)菌污染等）的影響。筆者在第4代細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重的霉菌污染，因此推斷第3代細(xì)胞已開始有霉菌的輕度污染，從而影響了第3代細(xì)胞的生長。

參考文獻(xiàn)

[1] TERADA S，F(xiàn)UCHS J R，YOSHIMOTO H，et al.In vitro cartilage regeneration from proliferated adult elastic chondrocytes[J].Ann Plast Surg，2005，55（2）：196-201.

[2] GORENSEK M，JAKSIMOVIC C，KREGAR-VELIKONJA N，et al.Nucleus pulposus repair with cultured autologous elastic cartilage derived chondrocytes[J].Cell Mol Biol Lett，2004，9（2）：363-373.

[3] MIZUNO M，KOBAYASHI S，TAKEBE T，et al.Reconstruction of joint hyaline cartilage by autologous progenitor cells derived from ear elastic cartilage[J].Stem Cells，2014，32（3）：816-821.

[4] 溫葉飛.耳廓軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性研究及組織工程軟骨的體外構(gòu)建初探[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2004.

[5] 常慶，張秀麗，蔣欣泉.AdLacZ基因修飾山羊耳軟骨細(xì)胞復(fù)合F127構(gòu)建組織工程化軟骨[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007（32）：6326-6329.

[6] 蔣欣泉，常慶，張秀麗，等.骨形成蛋白2基因修飾的山羊耳軟骨細(xì)胞體內(nèi)異位植入研究[J].中國口腔頜面外科雜志，2008（1）：38-42.

[7] 謝波，丁文峰，平亦雯，等.改良組織塊法培養(yǎng)原代兔耳軟骨細(xì)胞[J].塔里木大學(xué)學(xué)報(bào)，2013（2）：48-52.

[8] 冉鵬.人耳軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究[D].上海：復(fù)旦大學(xué)，2005.