小黑楊PsnAP1基因轉(zhuǎn)化煙草的研究

李爽　 鄭唐春　 臧麗娜等

摘要 [目的]研究楊樹APETALA1基因的功能，為縮短林木育種周期及楊樹成花機(jī)理的研究提供參考。[方法]以楊樹為研究對象，構(gòu)建植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草葉盤，并對轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行分子水平鑒定。[結(jié)果]楊樹APETALA1基因已經(jīng)整合入煙草基因組中，且轉(zhuǎn)基因煙草比野生型提早開花。[結(jié)論]楊樹APETALA1基因能促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株開花，為研究楊樹成花機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 楊樹；AP1；煙草；早花

中圖分類號 S792.11；Q786；S718.46 文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）08-02278-04

Transformation of Tobaccos with Two AP1 Genes Isolated from Poplar （Populus simonii×Populus nigra）

LI Shuang， QU Guanzheng et al （State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] To find the gene functions of AP1 of Populus simonii×Populus nigra and to lay the theoretical foundation for molecular regulation of floral meristem in poplar. [Method] The AP1 genes were constructed in plant expression vector and transformed into tobaccos using agrobacteriummediated procedure. Then， the transgenic tobaccos were identified by PCR. [Result] The AP1 genes were integrated into the genome of tobacco and the transgenic tobaccos all presented early flowering phenotype when comparing with the wild type tobacco. [Conclusion] The AP1 genes have a potentiality to promote early flowering in transgenic plants， and they lay the theoretical foundation for molecular regulation of floral meristem in poplar.

Key words Populus simonii×Populus nigra； AP1； Tobacco； Early flowering

高等植物由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的調(diào)節(jié)過程主要是由成花誘導(dǎo)控制的，同時受光周期等環(huán)境因素及內(nèi)源基因的調(diào)控。其中APETALA1（AP1）基因在花分生組織誘導(dǎo)和花器官發(fā)育過程中起雙重作用[1-2]。AP1基因?qū)儆贛ADSbox家族A類基因，在萼片和花瓣的發(fā)育過程中起重要作用[3-4]。研究結(jié)果表明，大多數(shù)轉(zhuǎn)AP1基因植物的開花時間都比野生型提前許多，這說明該基因在植物成花過程中起著非常重要的作用。Pen～a等將擬南芥的AP1基因或LFY基因?qū)敫涕俸?，轉(zhuǎn)基因植株不僅能當(dāng)年開花結(jié)實，并且可以通過種子獲得次年開花的植株[5]。Kotoda 等將蘋果的AP1基因遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥后，也可促使轉(zhuǎn)基因擬南芥提前開花[6]。Fernando和Zhang將柳樹的2個AP1基因轉(zhuǎn)入擬南芥后，不僅能使擬南芥提前開花，并能出現(xiàn)花瓣、雌蕊和雄蕊等畸形的現(xiàn)象[7]。Qu和Huang等將白樺BpAP1基因在煙草和白樺中進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明BpAP1基因在同源和異源轉(zhuǎn)化中，均可促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株提前開花，縮短植物的生長周期[8-10]。

楊樹被作為木本轉(zhuǎn)基因植物中的模式植物，是目前林木樹種遺傳轉(zhuǎn)化研究中的典型代表種[11]。小黑楊（Populus simonii×Populus nigra）是中國林業(yè)科學(xué)院于1959年經(jīng)小葉楊和黑楊雜交而來。多年實踐證明，小黑楊是速生豐產(chǎn)的好樹種，特別在黑龍江省西部干旱、寒冷地區(qū)長勢更好，10年即可成為建筑材。目前，關(guān)于楊樹AP1基因的功能驗證研究鮮有報道。筆者以小黑楊為試驗材料，從雄花芽cDNA中克隆出來2個AP1同源基因，通過構(gòu)建植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌侵染煙草，獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株，初步驗證了楊樹AP1基因能夠異源調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因煙草開花，以期為進(jìn)一步開展楊樹AP1基因的調(diào)節(jié)開花時間的功能驗證奠定基礎(chǔ)，從而為楊樹成花機(jī)理的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。楊樹花芽采自東北林業(yè)大學(xué)校園多年生的小黑楊雄株；野生型煙草（Nicotiana tabacum），由實驗室保存。

1.1.2 供試菌種。大腸桿菌DH5α感受態(tài)，購自天根生化科技有限公司；農(nóng)桿菌菌株EHA105，由實驗室保存。

1.1.3 主要試劑。質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒，購自美國OMEGA公司；PCR相關(guān)試劑、DNA marker、pMD18T載體、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA ligase和PrimeScriptTM RT reagent Kit，均購自日本TaKaRa公司；EasyPure Plant RNA Kit，購自中國Transgen公司；植物表達(dá)載體prok II質(zhì)粒，由山東師范大學(xué)張慧教授惠贈；其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1 小黑楊PsnAP1基因的克隆。用EasyPure Plant RNA Kit試劑盒提取小黑楊雄花芽的總RNA，檢測純度和濃度后，以0.5 μg總RNA為起始材料，采用PrimeScriptTM RT reagent Kit試劑盒進(jìn)行cDNA合成。以單鏈cDNA為模板，利用表1中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。通過表1引物擴(kuò)增目的片段，連接pMD18T載體后，送華大公司測序。測序成功后，分別利用限制性內(nèi)切酶Xba I、Kpn I雙酶切pMD18TPsnAP11和prok II質(zhì)粒，同時也用限制性內(nèi)切酶Bam H I、Sac I雙酶切pMD18TPsnAP12和prok II質(zhì)粒，分別回收目的片段后，利用T4 DNA連接酶連接后從而得到prok IIPsnAP11和prok IIPsnAP12植物表達(dá)載體。提取質(zhì)粒送北京華大公司測序，驗證是否將目的基因插入到植物表達(dá)載體prok II中。測序成功后，采用液氮凍融法將prok IIPsnAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆經(jīng)菌液PCR驗證陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.3 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。參考律鳳霞和趙勤的煙草轉(zhuǎn)化方法[12-13]，具體優(yōu)化如下：①制備侵染液。無菌操作下，將菌液（OD600=0.6）轉(zhuǎn)入離心管中，于3 000 r/min離心5 min，棄上清，將收集到的菌體用無菌水稀釋至終濃度為OD600=0.2～0.3，即可作為侵染用菌液。②侵染。無菌操作下，將切成長寬1.0 cm大小的煙草葉片，浸泡到侵染液中2～3 min，期間輕輕搖晃侵染液，然后用無菌濾紙吸去多余菌液。③共培養(yǎng)。將侵染過的葉片在不含抗生素的分化培養(yǎng)基（MS+0.5 mg/L 6BA+0.05 mg/L NAA）上培養(yǎng)，（25±2）℃暗培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)2 d。④脫菌。將共培養(yǎng)葉片在含有200 mg/L的頭孢霉素溶液中洗3～5 min，無菌濾紙吸干多余水分后，將葉片放在含有相應(yīng)抗生素的分生培養(yǎng)基（MS+0.5 mg/L 6BA+0.05 mg/L NAA+50 mg/L卡那霉素+500 mg/L頭孢霉素）上培養(yǎng)。第1周每隔2 d脫菌1次，之后每7 d脫菌1次，直至分化出小芽。⑤2次分化。待抗性芽長成葉片后，將葉片切下在含有抗生素的分生培養(yǎng)基上培養(yǎng)進(jìn)行2次篩選分化。⑥生根培養(yǎng)。待2次分化的不定芽長到1.0 cm左右時，將其切下，移入含抗生素的生根培養(yǎng)基上，進(jìn)行生根培養(yǎng)（MS+0.25 mg/L NAA+50 mg/L卡那霉素+500 mg/L頭孢霉素）。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測。CTAB法提取篩選后的煙草株系葉片DNA，進(jìn)行PCR檢測，篩選陽性株系。利用表1中構(gòu)建載體的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min，PCR結(jié)束后取3 μl反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小黑楊PsnAP1基因的克隆 利用RNA提取試劑盒，從小黑楊雄花芽中成功提取總RNA（圖1A），經(jīng)檢測濃度及質(zhì)量均可用于下一步試驗。以花芽總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，成功克隆到2條AP1基因序列（圖1B），暫時命名為PsnAP11（GenBank No.KC866354）和PsnAP12（GenBank No.KC866355）。通過對核酸序列分析發(fā)現(xiàn)，這2條同源基因的開放閱讀框（ORF）分別為726和750 bp，分別預(yù)測編碼241和249個氨基酸。預(yù)測結(jié)果顯示PsnAP11基因編碼蛋白的分子量大約為28.1 kDa，等電點pI為8.19；PsnAP12基因編碼蛋白的分子量大約為28.7 kDa，等電點pI為9.07。

2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及驗證 圖2 A～B表明，利用限制性內(nèi)切酶Xba I、Kpn I雙酶切pMD18TPsnAP11和prok II質(zhì)粒，同時也用限制性內(nèi)切酶Bam H I、Sac I雙酶切pMD18TPsnAP12和prok II質(zhì)粒，分別回收目的片段后，利用T4 DNA連接酶連接后從而得到prok IIPsnAP11和 prok IIPsnAP12植物表達(dá)載體（圖2 C、D、E）。分別挑取2個單克隆進(jìn)行初步質(zhì)粒PCR檢測，獲得750 bp左右目的條帶（圖3 B），同時分別隨機(jī)選取其中的2個條帶，經(jīng)過雙酶切均獲得750 bp左右目的條帶（圖3 A）。抽提質(zhì)粒送公司測序結(jié)果顯示，小黑楊PsnAP1基因分別整合到植物表達(dá)載體prok II中，未發(fā)生堿基突變，植物表達(dá)載體構(gòu)建完成。采用液氮凍融法將prok IIPsnAP11和 prok IIPsnAP12質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取4個單克隆經(jīng)菌液PCR驗證，結(jié)果顯示均為陽性轉(zhuǎn)化子（圖3 C）。

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及檢驗 用含有prok IIPsnAP1的農(nóng)桿菌EHA105浸染煙草葉片，經(jīng)4～5周的選擇培養(yǎng)，從葉片周圍的愈傷組織分化出綠色或淡綠色的不定芽（圖4 A）。將不定芽分割后培養(yǎng)，繼而生成大量從生芽。待抗性芽長成葉片后，將葉片切下在含有抗生素（50 mg/L卡那霉素）的分生培養(yǎng)基上培養(yǎng)進(jìn)行2次篩選分化。將從生芽分離后進(jìn)行生根定植，獲得完整轉(zhuǎn)基因煙草植株（圖4 C）。提取生根植株煙草葉片基因組DNA，利用構(gòu)建載體的引物對獲得的抗性植株進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果表明，在檢測的5株抗性煙草植株中，均擴(kuò)增出了與陽性對照相同AP1基因特異片段，其片段大小為750 bp左右；而以野生型煙草為對照的反應(yīng)，未擴(kuò)增出條帶，因此推測外源基因已經(jīng)整合入煙草基因組中（圖4 B）。試驗結(jié)果顯示，楊樹AP1基因能促進(jìn)轉(zhuǎn)基因煙草提前進(jìn)入花期，在組培瓶生根10 d后即能開花（圖4 C），將檢測為陽性的植株移栽到土里后，早花的轉(zhuǎn)基因植株能快速的開花結(jié)實，完成自己的生命周期（圖4 D）。

3 結(jié)論與討論

AP1基因自發(fā)現(xiàn)起一直廣受研究者的關(guān)注，擬南芥中AP1基因具有雙重功能，即作為擬南芥的花分生組織決定基因，在花原基發(fā)育早期階段起作用，又決定花器官起始和發(fā)育，AP1這種雙重功能反映在AP1表達(dá)模式上[14-15]。楊樹PsnAP1基因結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示，PsnAP11和PsnAP12均包含1個MADS盒和K盒并且位點相同，說明AP1基因在MADS盒區(qū)域高度保守；PsnAP11和PsnAP12雖然均有多個蛋白激酶C磷酸化位點和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，但兩者的功能結(jié)構(gòu)域存在著差異，它們的2級結(jié)構(gòu)也明顯不同，可以推測2個AP1同源基因在楊樹開花發(fā)育過程中的功能可能存在差異，需通過正向和反向遺傳學(xué)方法來驗證其生理功能。根據(jù)其不同物種中AP1基因的研究表明，AP1基因主要在生殖器官中表達(dá)，所以試驗選取材料時，以楊樹雄花芽進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。楊樹PsnAP1基因是否是開花的一個早期信號，成花進(jìn)程中促進(jìn)和抑制花芽分化的處理是否對其表達(dá)模式有影響，因為受取材時間的限制，尚未對PsnAP1基因在楊樹雌雄花器官的不同組織的時空表達(dá)模式進(jìn)一步研究。

植物花分生組織起始和花分生組織特性的維持是由花分生組織決定因子（LFY、AP1、CAL、FUL等）與TFL1的相互作用來完成，其中AP1是花序分生組織向花分生組織轉(zhuǎn)換最重要標(biāo)志物。研究表明，其與CAL、AGL24、SOC1、SEP3、SVP和AP3等多種MIKC型MADS蛋白發(fā)生相互作用[1618]。試驗將2條楊樹PsnAP1基因與植物表達(dá)表達(dá)載體重組，遺傳轉(zhuǎn)化煙草后，能促使轉(zhuǎn)基因植株提早開花，說明載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化順利完成。因此，可以利用獲得的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)一步分析其早花規(guī)律及轉(zhuǎn)基因植株中其他花分生組織決定因子的表達(dá)差異，為闡明楊樹AP1在林木成花中的作用奠定理論基礎(chǔ)。

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