激素配比與莖尖大小對甘薯脫毒苗培育的影響

盧玲　 聶明建　 代力

摘要 [目的]研究激素配比與莖尖大小對甘薯脫毒苗培育的影響。[方法]以高淀粉甘薯品種湘福1號和美國SL9為材料，進行甘薯脫毒苗培育試驗。[結(jié)果]湘福1號在MS+0.8 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA+0.05 mg/L GA3培養(yǎng)基中，愈傷組織生長最快，成苗率最高，1次培養(yǎng)成苗率比轉(zhuǎn)移的2次培養(yǎng)成苗率高24.5%，秧苗素質(zhì)也好；美國SL9莖尖所帶葉原基越多，則成苗率越高，脫毒率越低。[結(jié)論]綜合成苗率與脫毒效果認為，以帶2個葉原基的莖尖在含有激素的培養(yǎng)基中的培育效果最好。

關(guān)鍵詞 甘薯（Dioscorea esculenta）；莖尖；激素；成苗率；脫毒率

中圖分類號 S632 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）08-02276-02

Effects of Hormone Ratio and Shoot Tip Size on Dioscorea esculenta VirusFree Seedlings Culture

LU Ling， NIE Mingjian et al （Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128）

Abstract [Objective] To study effects of hormone ratio and shoot tip size on Dioscorea esculenta virusfree seedlings culture. [Method] With Xingfu No.1 and America SL9 as test materials， Dioscorea esculenta virusfree seedlings culture was conducted. [Result] The callus growth of Xiangfu No.1 in medium MS+0.8 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA+0.05 mg/L GA3 is the fastest and seedling rate is the highest， onetime culture seedling rate is higher than twotime culture seedling rate of 24.5%； The seedling rate of America SL9 is higher and virusfree rate is lower with more of leaf primordium in shoot tip. [Conclusion] Considering seedling rate and virusfree effect， the shoot tip with 2 leaf primordium in culture medium containing hormone has the best culture effect.

Key words Dioscorea esculenta； Shoot tip； Hormone； Virusfree rate

甘薯（Dioscorea esculenta）體內(nèi)感染了病毒病后會產(chǎn)生植株變小、分枝減少、葉片皺縮、生長勢衰退、塊莖變小、產(chǎn)量品質(zhì)明顯下降，甚至喪失生產(chǎn)利用價值的現(xiàn)象。利用莖尖分生組織培育脫毒甘薯苗進行栽培應(yīng)用，是防止甘薯病毒危害、提高甘薯產(chǎn)量和質(zhì)量最有效的方法。

甘薯脫病毒苗培育技術(shù)自20世紀80年代引入我國，國內(nèi)學者對其進行了大量研究，主要針對在甘薯莖尖表面消毒方法、消毒劑種類、消毒劑濃度及處理時間、培養(yǎng)莖尖的大小、培養(yǎng)基的成分、激素的濃度以及甘薯愈傷組織培養(yǎng)的溫光條件等方面，開展了一系列的研究工作，取得了很多成果[1-5]。何新民等以紅姑娘2號甘薯為材料誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織和叢芽階段，以MS+1.0 mg/L 6BA+0.01 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3培養(yǎng)基培養(yǎng)的效果較好；而1/2MS+0.2 mg/L NAA是紅姑娘2號試管苗的適宜生根培養(yǎng)基[6]。湖南是甘薯生產(chǎn)大省，甘薯年種植面積在15～20萬公頃，以高淀粉含量甘薯生產(chǎn)為主，據(jù)不完全統(tǒng)計，全省每年因甘薯病毒病造成的產(chǎn)量損失在30%以上。因此，筆者對湖南高淀粉甘薯品種脫毒苗培育技術(shù)進行研究，以期為高淀粉甘薯品種脫毒苗的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。供試品種為湘輻1號和美國SL9，淀粉含量分別達27%和25%，是湖南省目前栽培面積較大、產(chǎn)量及經(jīng)濟性狀均表現(xiàn)較好的2個高淀粉甘薯品種。

1.1.2 主要儀器。分析天平，購自德國賽多利斯公司；超凈工作臺，購自蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司；純水機，購自深圳市佐泰超聲自動化設(shè)備有限公司；高壓滅菌鍋，購自中遠機械有限公司；光照培養(yǎng)箱，購自常州恒德儀器有限公司；酸度計，購自梅特勒-托利多國際股份有限公司；水浴鍋，購自江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠。

1.1.3 主要藥劑。乙醇、次氯酸鈉、瓊脂、蔗糖、MS培養(yǎng)基、6BA、NAA、GA3、氫氧化鈉和鹽酸等均為國產(chǎn)分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1 種薯的催芽。選擇上一年收獲的中等大小、無病無傷、皮色鮮亮的甘薯，放入40～50 ℃恒溫水浴鍋中浸泡10 min，浸泡時需翻動種薯，保證種薯受熱均勻，然后按品種分類將種薯放置在32.5 ℃、相對濕度為80%的光照培養(yǎng)箱內(nèi)進行催芽培養(yǎng)，當種薯出現(xiàn)了芽尖時將溫度調(diào)至25～28 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 接種前準備。用濃度70%酒精擦拭培養(yǎng)器皿、解剖刀、剪刀和鑷子等接種器具。超凈工作臺先用浸有濃度70%酒精的脫脂棉擦洗，再經(jīng)紫外燈照射50 min消毒。組培瓶、培養(yǎng)皿、槍鑷等工具均需經(jīng)高壓蒸汽滅菌鍋滅菌。

1.2.3 外植體處理。甘薯出苗后，剪取生長健壯薯苗莖尖頂端2～3 cm，然后用飽和洗衣粉液浸泡消毒30 min，無菌水沖洗4～5次后，采用2步法表面消毒：先將甘薯莖尖先用濃度70%酒精浸泡30 s，再浸入濃度2.5%的NaClO水溶液消毒5～10 min，最后用無菌水沖洗4～5次，用無菌紙吸干，在解剖鏡下切取0.4～0.5 mm帶1～2個葉原基的甘薯微莖尖。

1.2.4 接種。打開組培瓶塑料蓋，用火焰燒瓶口并轉(zhuǎn)動瓶口，將槍鑷在火焰上消毒后蘸入無菌水冷卻，輕夾起已剪好的微莖尖接種至組培瓶內(nèi)的培養(yǎng)基上，蓋上塑料瓶蓋。

1.2.5 莖尖培養(yǎng)。將接種好的培養(yǎng)瓶放在人工氣候室中，培養(yǎng)室的條件設(shè)置為：溫度 25～28 ℃，相對濕度80%，光照時間14 h/d；光照強度2 000～3 000 lx。

1.2.6 病毒檢測。脫毒苗的檢測首先采取目測法淘汰弱苗和顯癥苗，再按王慶美改進的 NCMELISA法進行甘薯組培苗的病毒檢測[7]。

1.2.7 培養(yǎng)基的配制。甘薯莖尖分生組織的培養(yǎng)常用MS培養(yǎng)基，先配制MS母液，放入冰箱中保存待用，配制培養(yǎng)基時每升MS培養(yǎng)基母液中加入30 g蔗糖，然后用酸度計調(diào)整pH為5.8，按照試驗所設(shè)計的處理濃度將激素溶解在上述MS母液中，再加7 g瓊脂粉，分裝于組培瓶中，在121～126 ℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min，取出冷卻備用。

1.2.8 培養(yǎng)方式的選擇。①不同激素對甘薯莖尖分生組織培養(yǎng)的影響。以MS為基本培養(yǎng)基，然后根據(jù)生長激素配比的不同設(shè)計成8個處理。全部8個處理都添加了細胞分裂素6芐氨基嘌呤（6BA）和植物生長調(diào)節(jié)劑萘乙酸（NAA），其中編號1、2、5、6處理6BA濃度為0.4 mg/L，其他處理6BA濃度為0.8 mg/L，濃度增加1倍；編號1、3、5、7奇數(shù)處理NAA濃度為0.1 mg/L，偶數(shù)號2、4、6、8處理NAA濃度為0.2 mg/L，濃度增加1倍；另外，編號5、6、7、8處理添加了0.05 mg/L的赤霉素（GA3）（表1）。按“1.2.3”所述步驟處理湘輻1號外植體，然后剝離微莖尖（含2個葉原基），接種到各處理編號的培養(yǎng)基上，每個編號的培養(yǎng)基重復(fù)2次，每個重復(fù)5個微莖尖。在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計莖尖培育的愈傷組織直徑、成苗率。②莖尖大小對分生組織培養(yǎng)的影響。從美國SL9種薯上剪取芽尖，按“1.2.3”所述步驟消毒后，在解剖鏡下切取莖尖，進行接種培養(yǎng)。莖尖大小分為3個不同水平，分別帶有1、2和3個葉原基，培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基加0.8 mg/L 6BA和0.2 mg/L NAA，人工氣候室的條件與“1.2.5”相同，培養(yǎng)30 d統(tǒng)計成苗率，待莖尖長成完全植株，葉片展開時按“1.2.6”方法檢測其脫毒率。③不同培養(yǎng)方式對莖尖分生組織培養(yǎng)的影響。剝離的莖尖分生組織采用2種培養(yǎng)方式：1種是始終在篩選的激素培養(yǎng)基上培養(yǎng)，稱為1次培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成為MS培養(yǎng)基加0.8 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA+0.05 mg/L GA3；另1種是2次培養(yǎng)，即在激素培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d左右，待莖尖分生組織膨大變綠后，轉(zhuǎn)到1/2 MS無激素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。以湘輻1號為試驗材料，統(tǒng)計50 d后成苗率、莖尖芽數(shù)，葉片數(shù)、平均株高。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理。采用DPS數(shù)據(jù)處理和Excel進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基的莖尖分生組織培養(yǎng)效果分析 由表2可知，隨著6BA濃度升高，愈傷組織形成越快，面積越大、成苗率越高。處理1、2、5、6的6BA濃度愈為0.4 mg/L，愈傷組織平均直徑為26 mm，成苗率為48.5%；而處理3、4、7、8的6BA濃度愈為0.8 mg/L，愈傷組織平均直徑為30 mm，成苗率為50.2%，6BA濃度為0.8 mg/L的處理與0.4 mg/L處理相比，愈傷組織直徑增大15.4%，成活率高1.7%。

培養(yǎng)基中NAA濃度對甘薯莖尖愈傷組織形成的影響與6BA 相似，濃度升高，愈傷組織形成越快，面積越大、成苗率越高。處理編號2、4、6、8的愈傷組織平均直徑為30 mm，成苗率為50.8%；平均直徑比處理編號的1、3、5、7大4 mm，成苗率高2.9%。

GA3對甘薯組織培養(yǎng)也有重要影響，添加了0.05 mg/L GA3后，愈傷組織平均直徑為32.3 mm，而未添加GA3的愈傷組織平均直徑僅為23.8 mm，前者比后者直徑增大35.7%，這說明GA3有促進甘薯愈傷組織生長的作用。在沒有添加0.05 mg/L GA3 的情況下，6BA濃度對甘薯莖尖愈傷組織形成的快慢及直徑大小影響更大，處理3、4的愈傷組織平均直徑為27 mm，處理1、2的為20.5 mm。6BA濃度為0.8 mg/L的處理比0.4 mg/L處理相大31.7%，說明添加GA3可以部分抵消6BA濃度差異對愈傷組織培育的影響。

2.2 莖尖大小對分生組織培養(yǎng)的影響 由表3可知，莖尖大小對分生組織培養(yǎng)有很大的影響。莖尖帶1、2和3個葉原基的成苗率分別為30.5%、50.1%和79.4%，帶3個葉原基的莖尖分別比帶2個和1個葉原基的莖尖成苗率高29.3%和48.9%，表明莖尖大小與組織培養(yǎng)的成活率呈正比。脫毒率則正好相反，莖尖越大，脫毒效果越差，帶1、2和3個葉原基莖尖的脫毒率率分別為50.2%、42.7%和27.9%，帶1個葉原基的莖尖比帶2個和3個葉原基的莖尖脫毒率分別高7.5%和22.3%，表明莖尖大小與脫毒率呈反比。在培養(yǎng)過程中還發(fā)現(xiàn)，帶1個葉原基的莖尖比帶2個葉原基、3個葉原基愈傷組織生長慢，根和葉分化也慢。

2.3 不同培養(yǎng)方式對莖尖分生組織培養(yǎng)的影響 由表4可知，1次培養(yǎng)的成苗率、莖尖芽數(shù)、葉片數(shù)和平均株高都比2次培養(yǎng)的高。1次培養(yǎng)比2次培養(yǎng)成苗率增加了24.5%，莖