長(zhǎng)江口可培養(yǎng)耐（嗜）鹽細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究

孟凡旭，吳月紅，金文靜，王春生，許學(xué)偉

（1.國(guó)家海洋局 海洋生態(tài)系統(tǒng)與生物地球化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310012；2.國(guó)家海洋局 第二海洋研究所，浙江 杭州 310012；3.浙江海洋學(xué)院 蕭山校區(qū)基礎(chǔ)部，浙江 杭州 311231）

0 引言

自然環(huán)境中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究在微生物生態(tài)學(xué)中具有重要意義［1］。群落結(jié)構(gòu)反映了微生物所處生境的特征，通過(guò)群落結(jié)構(gòu)研究，可分析微生物在生態(tài)系統(tǒng)中的功能及其在生物地球化學(xué)循環(huán)中的作用。

長(zhǎng)江口由于受長(zhǎng)江徑流影響，鹽度變化較大。長(zhǎng)江口及沖淡水區(qū)是不同水團(tuán)的交匯區(qū)，南部臺(tái)灣暖流攜帶的高鹽水沿海洋底部深谷自東南楔入該交匯區(qū)，北部低鹽的黃海水團(tuán)沿蘇北沿岸到達(dá)該區(qū)，長(zhǎng)江沖淡水則向東北方向擴(kuò)展［2］。此外，被長(zhǎng)江徑流攜帶進(jìn)入海洋的大量陸源溶解營(yíng)養(yǎng)鹽可直接影響河口的初級(jí)生產(chǎn)力，間接影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和分布［3－4］。鹽度和營(yíng)養(yǎng)鹽的復(fù)雜變化，必然對(duì)長(zhǎng)江口海洋微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生深刻的影響。

對(duì)鹽環(huán)境中的微生物而言，鹽份是影響其生長(zhǎng)繁殖的非生物主導(dǎo)因子。以微生物的NaCl耐受實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為依據(jù)，KUSHNER［5］和 VENTOSA et al［6］把鹽環(huán)境中生存的微生物劃分為不同的生理類(lèi)型：可在0%（w／v）鹽含量下生長(zhǎng)的細(xì)菌屬于耐鹽菌，不能在0%wv鹽含量下生長(zhǎng)但能在0.5%wv 鹽含量下生長(zhǎng)的細(xì)菌屬于中度嗜鹽菌。

我國(guó)對(duì)長(zhǎng)江口海洋微生物群落結(jié)構(gòu)研究較少，該海域浮游耐鹽細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的數(shù)據(jù)尤為缺乏［7－9］。本文針對(duì)長(zhǎng)江口10個(gè)站位樣品，分離培養(yǎng)耐鹽細(xì)菌并開(kāi)展系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究，分析了長(zhǎng)江口耐鹽細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性，并對(duì)這些海洋優(yōu)勢(shì)耐鹽細(xì)菌類(lèi)群在海洋環(huán)境中的作用進(jìn)行了初步探討。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2007年在中國(guó)東海（30～32°N，121～127°E）采集了10個(gè)站位的表層和底層水（或多管上覆水）共26個(gè)樣品（采樣站位見(jiàn)圖1），裝無(wú)菌采樣瓶后運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室4℃保存。

1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

采用高鹽度HM培養(yǎng)基和低鹽度ZMCA培養(yǎng)基分離純化海洋微生物［10］。HM培養(yǎng)基配方：氯化鈉100.0g，氯化鉀2.0g，硫酸鎂（七水）1.0g，氯化鈣（二水）0.36g，溴化鈉0.23g，碳酸氫鈉0.06g，氯化鐵微量，葡萄糖1.0g，peptone（Difco）5g，yeast extract（Difco）10g，PH 7.5。ZMCA培養(yǎng)基配方：氯化鈉19.45g，氯化鎂8.8g，硫酸鈉3.24g，氯化鈣1.8g，氯化鉀0.55g，碳酸氫鈉0.16g，檸檬酸鐵（五水）0.1g，溴化鉀0.08g，氯化銫34mg，硼酸22mg，硅酸鈉4.0mg，氟化鈉2.4mg，硝酸銨1.6mg，磷酸鈉8.0mg，peptone（Difco）0.5g，yeast extract（Difco）0.1g，pH 7.2。

水樣混勻，取80μL涂布于HM 1／10營(yíng)養(yǎng)（即HM培養(yǎng)基中peptone、yeast extract和葡萄糖取1／10量，其它不變）和ZMCA平板，倒置于培養(yǎng)箱中，28℃光照培養(yǎng)3～5d。每個(gè)樣品挑取5個(gè)以上（M5－1和M5－4站位每個(gè)樣品挑取3個(gè)以上）不同形態(tài)特征的菌落，接種于HM液體試管，28℃光照條件下，150r／min搖床震蕩培養(yǎng)至菌液變渾濁，利用三線(xiàn)法平板劃線(xiàn)純化。純化菌株用HM斜面4℃和甘油管－80℃保藏。

1.3 菌株形態(tài)特征觀察

采用活體觀察和透射電鏡觀察2種方式。

活體觀察：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液涂于載玻片上，通過(guò)光學(xué)顯微鏡（Olympus BX40）觀察細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性及形態(tài)特征。

透射電鏡觀察：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的劃線(xiàn)斜面，刮取菌體懸浮于無(wú)菌水中制成菌懸液。將菌懸液滴于銅網(wǎng)上并用濾紙吸去多余液體，然后用醋酸雙氧鈾染色。制作細(xì)胞超薄切片時(shí)，以2.5%vv戊二醛固定細(xì)胞，并通過(guò)鋨酸固定、乙醇脫水、包埋、切片和醋酸雙氧鈾染色等步驟制備切片樣品。在透射電鏡（JEM－1230）下觀察細(xì)胞的形態(tài)、大小、分裂方式、芽孢產(chǎn)生、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、內(nèi)涵體和鞭毛數(shù)量及形態(tài)等情況。

1.4 耐鹽性實(shí)驗(yàn)

菌液以1%（v／v）接種量接入3mL 0%（w／v）NaCl HM液體試管和0.5% （w／v）NaCl HM 液體試管，置于恒溫?fù)u床28℃震蕩培養(yǎng)，每天觀察生長(zhǎng)情況，連續(xù)觀察記錄一周。

1.5 硝酸鹽、亞硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)

菌液以10% （v／v）接種量（300μL）接入0.2%（w／v）KNO3和0.05%（w／v）NaNO2HM 液體試管，培養(yǎng)3～7d，待菌液生長(zhǎng)渾濁后進(jìn)行Griess檢驗(yàn)。

在比色瓷盤(pán)小窩中倒入少許培養(yǎng)液，分別加1滴Griess A液及B液，在不接種對(duì)照中也同樣加入A液和B液各一滴。若無(wú)色再加入1到2滴二苯胺試劑，溶液變?yōu)榉奂t色、玫瑰紅色、橙色、棕色等表明亞硝酸鹽存在。加入二苯胺試劑后，不呈藍(lán)色反應(yīng)，表明硝酸鹽和形成的亞硝酸鹽都已還原成其他物質(zhì)；加入二苯胺試劑后，呈藍(lán)色反應(yīng)，表明培養(yǎng)液中仍有硝酸鹽。

Griess試劑A液配方為0.5g對(duì)氨基苯磺酸和150mL 10%（v／v）稀醋酸。Griess試劑B液配方為0.1gα－萘胺，20mL蒸餾水和150mL 10%（v／v）稀醋酸。二苯胺試劑配方為0.5g二苯胺溶于100mL濃硫酸中，用20mL蒸餾水稀釋。

1.6 分離純化菌株的分子鑒定

采用菌液PCR法擴(kuò)增純培養(yǎng)物16SrDNA序列，PCR擴(kuò)增引物為27bf（5'－AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG－3'）和 1 492br（5'－ACG GHT ACC TTG TTA CGA CTT－3'）。

50μL反應(yīng)體系為：5μL 10×PCR Buffer，0.5μL dNTP Mixtures（10mmol／L），1μL Primer 27bf和Primer 1 492br（4μmol／L），41μL H2O，1μL模板DNA，0.5 μL Taq酶（Takara）。PCR反應(yīng)條件為：50μL反應(yīng)體系加入50ng DNA模板，33個(gè)循環(huán)：變性94℃，45s；退火55℃，45s；延伸72℃，90s。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京諾賽基因公司進(jìn)行純化并進(jìn)行DNA序列測(cè)定，測(cè)序引物為27bf，測(cè)定的序列長(zhǎng)度大于500bp。測(cè)定序列采用Blastn進(jìn)行比對(duì)。相似性低于97%的序列，采用27bf和1 492br重新進(jìn)行測(cè)定。重新測(cè)定后的序列長(zhǎng)度大于1 300bp，為16SrDNA序列長(zhǎng)度的90%以上。

1.7 長(zhǎng)江口細(xì)菌多樣性分析

根據(jù)EzTaxon－e比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將獲得的16SrDNA序列進(jìn)行歸類(lèi)，定義相似性小于97%的序列作為不同分類(lèi)單元，采用物種多樣性、豐富度、均勻度和優(yōu)勢(shì)度指數(shù)進(jìn)行多樣性分析。

細(xì)菌序列與從數(shù)據(jù)庫(kù)（EzTaxon－e）中獲得的相近序列，應(yīng)用Mega 5.05進(jìn)行多序列匹配比對(duì)，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并通過(guò)自展分析進(jìn)行置信度檢測(cè)，自展數(shù)據(jù)集為1 000次。

2 結(jié)果與討論

2.1 環(huán)境特征

長(zhǎng)江口、杭州灣及沖淡水區(qū)是一個(gè)不同水團(tuán)的交匯區(qū)，由近岸向外海，由灣頂向?yàn)晨?，鹽度逐漸增高，全水域變幅為0.03～34.5。長(zhǎng)江口、杭州灣及其口門(mén)附近海域?yàn)辂}度最低區(qū)域，M5－1、N6－2和 M4－1三個(gè)站位處于該區(qū)域，鹽度小于20（圖1a）。硝酸鹽濃度在灣頂最高，達(dá)到125.88μmol／L（圖1b）。

圖1 采樣站位鹽度（a）和硝酸鹽含量（b）Fig.1 Salinity（a）and nitrate concentration（b）of sampling stations

圖2 菌株L039細(xì)胞形態(tài)圖Fig.2 Cell morphology of strain L039

2.2 長(zhǎng)江口細(xì)菌的分離及分子鑒定

根據(jù)菌落大小、形態(tài)和顏色等特征，挑取分離平板上的單菌落進(jìn)行四分劃線(xiàn)純化，分別通過(guò)HM培養(yǎng)基和ZMCA培養(yǎng)基從長(zhǎng)江口水樣中分離得到136株菌和20株菌。以L039菌株為例，菌落無(wú)色，圓形，略微凸起，直徑為1～2mm，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)菌具有單極鞭毛（圖2）。

采用細(xì)菌通用引物，擴(kuò)增獲取了156株菌株的16S rDNA序列。分子鑒定結(jié)果表明，以HM培養(yǎng)基分離的136株菌株可劃分至33個(gè)不同的分類(lèi)單元（OTU），這些菌株分別屬于α－變形菌綱（Alphaproteobacteria，7株， 5.15%γ－變形菌綱（Gammaproteobacteria86株，63.2%）和厚壁菌門(mén)中的芽孢桿菌綱（Bacilli，43株，31.6%）3個(gè)類(lèi)群（表1和圖3）。α－變形菌綱分屬于海棲菌屬（Oceanicola）、箭頭菌屬（Sagittula）、橙色單胞菌屬（Aurantimonas）和斯塔普氏菌屬（Stappia）；γ－變形菌綱分屬于交替單胞菌屬（Alteromonas）、海桿菌屬（Marinobacter）和假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）；芽孢桿菌綱分屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、薄壁芽孢桿菌屬（Gracilibacillus）、海洋芽胞桿菌屬（Oceanobacillus）、鹽芽孢桿菌屬（Halobacillus）和深海芽孢桿菌屬（Thalassobacillus）。以ZMCA培養(yǎng)基分離獲得的20株菌株分屬α－變形菌綱（Alphaproteobacteria，16株，80%）和放線(xiàn)菌綱（Actinobacteria4株，20% 兩個(gè)類(lèi)群，可劃分為10個(gè)不同的分類(lèi)單元。

圖3 HM培養(yǎng)基分離細(xì)菌在各站位類(lèi)群分布Fig.3 Distribution of bacteria isolated from medium HM within different stations

表1 長(zhǎng)江口細(xì)菌類(lèi)群數(shù)量及多樣性指數(shù)Tab.1 Number of cultured marine bacteria and diversity indices in the Changjiang River Estuary

圖4 長(zhǎng)江口可培養(yǎng)耐鹽變形菌門(mén)細(xì)菌16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of 16SrDNA sequences of Proteobacteria strains from the seawater in the Changjiang River Estuary

α－變形菌綱細(xì)菌對(duì)環(huán)境依賴(lài)程度較大，多數(shù)為嚴(yán)格好養(yǎng)微生物，一旦面臨惡劣環(huán)境容易發(fā)生不可逆損傷而不能增殖。在高鹽條件下分離獲得的α－變形菌綱細(xì)菌數(shù)量少，隸屬于4個(gè)屬。γ－變形菌綱的細(xì)菌適應(yīng)性較強(qiáng)，能利用多種碳源物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)［11］，它們?cè)诓煌h(huán)境的生態(tài)系統(tǒng)中都有廣泛的分布［12］。其中，交替單胞菌屬?gòu)V泛分布于海水中，且在開(kāi)放海域及海岸均有分布，該類(lèi)群好氧、化能異養(yǎng)，能利用短鏈脂肪酸和一些烷烴作為唯一碳源；海桿菌屬多數(shù)為兼性好養(yǎng)菌，其生存范圍較為寬廣［13］，是海水中可培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌；假交替單胞菌屬據(jù)報(bào)道具有殺藻的能力［14－15］。厚壁菌門(mén)細(xì)菌生存范圍較為寬廣，具有很好的環(huán)境適應(yīng)性。從靠近海岸的站點(diǎn)（M5－1、N6－2和M4－1）分離得到的細(xì)菌均為厚壁菌門(mén)（Firmicutes）微生物，而遠(yuǎn)離海岸的站點(diǎn)細(xì)菌均屬于變形菌門(mén)（圖3），可見(jiàn)靠近海岸的站點(diǎn)和遠(yuǎn)離海岸的站點(diǎn)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯，這與 M5－1，N6－2和 M4－1三個(gè)站位受到長(zhǎng)江口和杭州灣淡水的影響鹽度變化較大，同時(shí)受長(zhǎng)江口外長(zhǎng)期缺氧及陸源污染物的影響有關(guān)，也表明厚壁菌門(mén)細(xì)菌對(duì)這種特殊的環(huán)境具有更好的適應(yīng)性。

圖5 長(zhǎng)江口可培養(yǎng)耐鹽厚壁菌門(mén)細(xì)菌16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of 16SrDNA sequences of Firmicutes strains from the seawater in the Changjiang River Estuary

分離所得變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)微生物及其相鄰菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖4和圖5所示，圖中標(biāo)尺為每個(gè)核苷酸置換率為0.02，置信度小于60的未標(biāo)出數(shù)值。分離所得大多數(shù)菌株與已報(bào)道的分離自海洋或其他環(huán)境的微生物相似性很高（＞97%），但研究也發(fā)現(xiàn)一些菌株與已報(bào)道標(biāo)準(zhǔn)菌株間的相似度較低。如L039與Pseudoalteromonasbyunsanensis的相似性為97%，可能代表了新的分類(lèi)單元。

2.3 長(zhǎng)江口細(xì)菌多樣性分析

物種多樣性是把物種的數(shù)目和個(gè)體數(shù)目分配狀況（豐度和均勻度）結(jié)合起來(lái)考慮的一個(gè)統(tǒng)計(jì)量，它反映了生物群落和生態(tài)系統(tǒng)的特征，例如結(jié)構(gòu)類(lèi)型、發(fā)展階段、穩(wěn)定程度和生境差異等等。Shannon多樣性指數(shù)和Margalef豐富度指數(shù)是對(duì)稀有物種敏感的指數(shù)；與之相反，Shannon均勻度指數(shù)和Berger－Parker優(yōu)勢(shì)度指數(shù)屬于對(duì)富集種相對(duì)敏感的指數(shù)。

從分離結(jié)果來(lái)看，長(zhǎng)江口細(xì)菌具有較好的物種多樣性（表1），且其中一些菌株與已報(bào)道菌株16SrDNA序列間差異較大，說(shuō)明我國(guó)長(zhǎng)江口水域有許多未被發(fā)現(xiàn)的微生物資源。由于培養(yǎng)基對(duì)微生物的選擇性及培養(yǎng)條件的局限性，分離的菌株集中于變形菌門(mén)等少數(shù)門(mén)類(lèi)，大量難培養(yǎng)微生物的分離尚有待于探索。HM培養(yǎng)基為模擬海產(chǎn)品腌制的高鹽度培養(yǎng)基，ZMCA培養(yǎng)基為模擬海洋環(huán)境的低鹽度培養(yǎng)基，以這2種培養(yǎng)基分離的菌株多樣性指數(shù)略有差異但不明顯（表1）。HM培養(yǎng)基分離得到的細(xì)菌多樣性較ZMCA培養(yǎng)基差，與HM培養(yǎng)基鹽度較高，對(duì)微生物篩選作用較強(qiáng)有關(guān)；ZMCA培養(yǎng)基是一種寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，相比其他普通培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基降低了營(yíng)養(yǎng)成分濃度，可在很大程度上避免少數(shù)菌株生長(zhǎng)過(guò)快導(dǎo)致多樣性偏低的現(xiàn)象。

2.4 長(zhǎng)江口細(xì)菌耐鹽性、硝酸鹽還原性和亞硝酸鹽還原性分析

通過(guò)HM培養(yǎng)基分離培養(yǎng)獲得的136株菌株中，有70.5%的菌株可在0%（w／v）NaCl條件下生長(zhǎng)，屬于耐鹽菌；25.9%菌株不能在0%（w／v）NaCl條件下生長(zhǎng)但能在0.5%（w／v）NaCl條件下生長(zhǎng)，屬于中度嗜鹽菌；另外3.59%菌株不能在小于0.5%（w／v）NaCl條件下生長(zhǎng)，生長(zhǎng)的下限未知，能耐受10%（w／v）的NaCl，也屬于中度嗜鹽菌。通過(guò)ZMCA培養(yǎng)基分離獲得的菌株均可在0%（w／v）NaCl條件下生長(zhǎng)，屬于耐鹽菌。

通過(guò)分離結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)與陸地不同距離的站位其微生物類(lèi)群有很大不同。長(zhǎng)江口受淡水流入影響，鹽度變化較大，該系統(tǒng)中的微生物部分來(lái)自海洋，另一部分則來(lái)自陸地并適應(yīng)了海洋環(huán)境，鹽濃度適應(yīng)也是其表現(xiàn)之一。

對(duì)分離自HM培養(yǎng)基的136株細(xì)菌的硝酸鹽和亞硝酸鹽還原性分析表明，30.3%的細(xì)菌能還原硝酸鹽，而只有9.90%的細(xì)菌能還原亞硝酸鹽，其數(shù)量?jī)H為硝酸鹽還原細(xì)菌的1／3左右。

3 結(jié)論

本研究采用HM培養(yǎng)基和ZMCA培養(yǎng)基，分離培養(yǎng)得到長(zhǎng)江口10個(gè)站位樣品的耐（嗜）鹽菌156株，分析分離得到的菌株可知：

（1）以HM培養(yǎng)基分離獲得136株菌株，可劃分為33個(gè)分類(lèi)單元，分屬于α－變形菌綱、γ－變形菌綱和厚壁菌門(mén)中的芽孢桿菌綱3個(gè)類(lèi)群，其中γ－變形菌綱為優(yōu)勢(shì)耐（嗜）鹽細(xì)菌。與陸地不同距離的站位其微生物類(lèi)群有很大不同：靠近海岸的站點(diǎn) M5－1，N6－2和 M4－1耐（嗜）鹽細(xì)菌均屬于厚壁菌門(mén)，而遠(yuǎn)離海岸的站點(diǎn)耐（嗜）鹽細(xì)菌均屬于變形菌門(mén)。由HM培養(yǎng)基分離獲得的菌株中，耐鹽菌占70.5%，中度嗜鹽菌占29.5%。

（2）以ZMCA培養(yǎng)基分離獲得的20株菌株分屬α－變形菌綱（80%）和放線(xiàn)菌綱（20%），可劃分為10個(gè)分類(lèi)單元。由ZMCA培養(yǎng)基分離獲得的菌株均為耐鹽菌。

（3）HM培養(yǎng)基分離得到的136株細(xì)菌的硝酸鹽和亞硝酸鹽還原性分析表明，亞硝酸鹽還原菌數(shù)量?jī)H為硝酸鹽還原菌的1／3左右。這表明在海產(chǎn)品腌制過(guò)程中，亞硝酸鹽的產(chǎn)生速度可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其轉(zhuǎn)化為N2或N2O的速度，由于亞硝酸鹽具有毒性，在腌制海產(chǎn)品這種高鹽的閉合環(huán)境中，亞硝酸鹽的積累過(guò)程和轉(zhuǎn)化效率是關(guān)系到食品安全的重要問(wèn)題，應(yīng)引起足夠的重視。

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