天竺桂葉片抗寒性生理生化指標(biāo)測定及綜合評價

李紅喜，陳新會，康戰(zhàn)芳，陳秋紅

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天竺桂葉片抗寒性生理生化指標(biāo)測定及綜合評價

李紅喜，陳新會，康戰(zhàn)芳，陳秋紅

（欒川縣林業(yè)局，河南 欒川 471500）

通過低溫脅迫實驗，對河南欒川和湖北襄陽天竺桂葉片的含水量、相對含水量、脯氨酸含量、葉綠素含量、細胞膜透性、MDA含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、SOD活性、CAT活性、APX活性等生理生化指標(biāo)測定。綜合各項指標(biāo)表明河南欒川天竺桂葉片耐受低溫為-20℃，湖北襄陽天竺桂葉片耐受低溫為-16℃。

天竺桂；抗寒性；生理生化測定；評價

天竺桂屬于亞熱帶植物，志書記載均分布在伏牛山南坡以南的亞熱帶地區(qū)，伏牛山北坡暖溫帶地區(qū)沒有分布[1]。2004年，通過對暖溫帶地區(qū)伏牛山北坡調(diào)查，天竺桂野生資源在欒川縣老君山自然保護區(qū)首次發(fā)現(xiàn)，2005年在欒川縣龍峪灣國家森林公園發(fā)現(xiàn)小型群落，2010年在欒川縣潭頭鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)原生群落，最大直徑28 cm。野生天竺桂在欒川的發(fā)現(xiàn)，突破了常規(guī)栽培的北限，擴大了天竺桂的栽培范圍，改變了天竺桂只能南方栽培的格局，這為天竺桂在北方栽培和綠化，提供了前所未有的契機，具有重大的科研價值和市場空間[2]。

目前國內(nèi)對天竺桂引種適應(yīng)性實驗和生理生化機制研究較少，為了對天竺桂的引種提供有價值的參考，并通過天竺桂抗寒生理生化研究，為天竺桂引種馴化及繁育開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。2013年1月，在河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院實驗室對河南欒川天竺桂和湖北襄陽天竺桂進行抗寒生理生化指標(biāo)進行測定。

1 材料與方法

1.1 植物材料

為湖北襄陽天竺桂和河南欒川天竺桂葉片。采集地點：河南省欒川縣苗圃。

1.2 試驗試劑及儀器

1.2.1試驗試劑

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、核黃素、甲硫氨酸、EDTA-Na2、氯化硝基四挫藍、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、L-抗壞血酸鈉、過氧化氫、可溶性聚乙烯吡咯烷酮、考馬斯亮藍-G250、冰醋酸、磷酸、無水乙醇、3%磺基水楊酸、冰乙酸、酸性茚三酮、甲苯。

1.2.2試驗儀器

BL-610分析天平和BS-200S型分析天平、pHS-3型數(shù)顯酸度計、3K18臺式高速冷凍離心機、HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋、TU-1810紫外可見分光光度計、2XZ-1型真空泵、DZG-6090型真空干燥箱、78-1型磁力加熱攪拌器、Sigma移液槍、TYS-3N葉綠素檢測儀、DDS-307型電導(dǎo)率儀、BCD-28EMC型冷藏冷凍箱。

1.3 試驗方法

對所采集的天竺桂枝葉用保鮮箱送至實驗室，放置于低溫程序控制冰箱中，模擬自然條件下的低溫狀況，溫度分別設(shè)置為4℃、-4℃、-8℃、-12℃、-16℃、-20℃，室溫CK作為對照。低溫程序控制冰箱每10 min下降1℃，到所需的溫度后放置24 h，然后取出部分樣品放置于室溫下15 h后進行測定。剩下的樣品繼續(xù)按設(shè)定梯度處理。

1.3.1葉片含水量的測定

取低溫脅迫的天竺桂葉片，每個溫度為一組，隨機取2~3片葉，稱重并記錄；然后將葉片放入盛有自來水的培養(yǎng)皿中，室溫放置8 h，取出稱重記錄；將葉片用報紙包裹并標(biāo)記，在電熱恒溫干燥箱中80℃烘12 h后稱干重并記錄。

1.3.2游離脯氨酸含量測定

取不同處理的剪碎混勻天竺桂葉片0.4 g，分別置于大試管中，加入5 ml 3%磺基水楊酸溶液，管口加蓋玻璃球，于沸水浴中浸提10 min。取出試管冷卻后，吸取上清液2 ml，加2 ml冰乙酸和3 ml顯色液，于沸水水浴中加熱40 min，下一步操作按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法進行甲苯萃取和比色，記錄吸光值。

1.3.3葉綠素含量測定

隨機選取5~6片低溫脅迫的葉片，用手持葉綠素檢測儀對葉片不同部位進行葉綠素含量測定并記錄。

SOD、APX、CAT酶活性及MDA、可溶性蛋白質(zhì)含量和相對電導(dǎo)率大小測定參考趙世杰等、葉寶興方法[3-4]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

MierosoftExel作圖；SPSS13.0做統(tǒng)計分析。

2 實驗數(shù)據(jù)

低溫脅迫下，湖北襄陽天竺桂和河南欒川天竺桂葉片的含水量和相對含水量、脯氨酸含量、葉綠素含量、細胞膜透性、丙二醛（MDA）含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、SOD活性、過氧化氫酶（CAT）活性、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性等生理生化變化情況如圖1~8。

圖1 天竺桂葉片細胞膜透性變化

圖2 天竺桂葉片脯氨酸含量變化

圖3 天竺桂葉片葉綠素含量變化

圖4 天竺桂葉片可溶性蛋白含量變化

圖5 天竺桂葉片丙二醛（MDA）含量變化

圖6 天竺桂葉片過氧化氫酶（CAT)含量變化

圖7 天竺桂葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性變化

圖8 天竺桂葉片過氧化物酶（APX）含量變化

3 小結(jié)

植物對低溫脅迫的響應(yīng)是積極主動的應(yīng)激過程，低溫誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達[5]。抗寒性指植物不受凍害所能忍耐的冰凍溫度[6]。環(huán)境脅迫下植物的抗性反應(yīng)是一個復(fù)雜的生理、生化、生態(tài)過程，并且各種生理生化反應(yīng)之間相互影響、相互作用。由于植物的抗寒性是受多種因素的影響而形成的，它涉及到植物的組織結(jié)構(gòu)功能和一系列生理生化問題。通過低溫脅迫實驗，測定了包括葉片含水量和相對含水量、脯氨酸含量、葉綠素含量、細胞膜透性、MDA含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、SOD活性、CAT活性、APX活性等生理生化指標(biāo)，進一步分析了不同地區(qū)天竺桂抗寒性與每一種指標(biāo)之間的關(guān)系。通過這項指標(biāo)可以看出，河南欒川天竺桂抗寒性高于湖北襄陽天竺桂。

在遇到低溫傷害時，湖北襄陽天竺桂葉片比河南欒川天竺桂葉片細胞膜透性變化要大。在透性達到最大值的低溫溫度上，湖北襄陽天竺桂抗性是-16℃，河南欒川天竺桂是-20℃。按照細胞膜透性越大，則其抗性越小的理論，湖北襄陽天竺桂抗寒性不如河南欒川天竺桂。

在低溫脅迫過程中，當(dāng)?shù)蜏亟抵?20℃時，MDA含量變化出現(xiàn)兩種情況，河南欒川天竺桂MDA含量上升，湖北襄陽天竺桂MDA含量下降，表明在-20℃時河南欒川天竺桂葉片受害持續(xù)，還有生命特征，湖北襄陽天竺桂葉片基本死亡，基本沒有生命特征。同時，在低溫脅迫過程中，河南欒川天竺桂和湖北襄陽天竺桂相比，其MDA含量較低，變化幅度較小，說明河南欒川天竺桂抗寒性大于湖北襄陽天竺桂，這與蘋果砧木低溫脅迫研究得出的結(jié)果一致[7]。

在低溫脅迫過程中，不同地區(qū)天竺桂酶促清除系統(tǒng)反應(yīng)不同，酶促清除系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和過氧化氫酶(CAT)等[107]。河南欒川天竺桂葉片在溫度降至4℃時，SOD、CAT、APX活性全部啟動，協(xié)同抵御不良環(huán)境；隨著溫度下降，SOD和CAT活性最先降低（-4℃），最后是APX（-8℃）；接著CAT活性被再次激活（-8℃），其次SOD活性也被激活（-12℃），最后是APX（-16℃）；到-16℃時SOD、APX活性被繼續(xù)激活，CAT活性下降；到-20℃時只有SOD活性被繼續(xù)激活，CAT、APX活性下降，表明河南欒川天竺桂自身生理機能較差，自身抗性降到較低水平。湖北襄陽天竺桂葉片在溫度降至4℃時，APX和CAT活性最先降低（-4℃），SOD活性慢慢喚醒；隨著溫度下降，APX活性被喚醒（-4℃），到-8℃CAT活性才被激活，表明在遇到低溫危害時，湖北襄陽天竺桂自身反應(yīng)機制較慢；在低溫降到-16℃時，APX活性急速下降，CAT活性急速上升，SOD活性在也-12℃以下變化不大；到-20℃時只有CAT活性被繼續(xù)激活，SOD、APX活性下降，表明湖北襄陽天竺桂自身生理機能較差，自身抗性降到較低水平。從低溫脅迫過程不同地區(qū)天竺桂酶促清除系統(tǒng)活性對比可以看出，SOD活性相近，CAT、APX活性相比河南欒川天竺桂均低于湖北襄陽天竺桂，酶促清除系統(tǒng)是由于膜脂過氧化作用變化而變化的，這表明在抵御細胞膜的脂質(zhì)過氧化過程中，河南欒川天竺桂均自身調(diào)節(jié)、回避機制高于湖北襄陽天竺桂，也就是說河南欒川天竺桂自身的適應(yīng)能力大于湖北襄陽天竺桂，使得在低溫脅迫下，河南欒川天竺桂對不良環(huán)境的反應(yīng)小于湖北襄陽天竺桂。

河南欒川天竺桂葉片含水量均低于湖北襄陽天竺桂，表明河南欒川天竺桂在自然適應(yīng)過程中，通過降低葉片含水量來抵御低溫危害；在葉片相對含水量對比試驗中，河南欒川天竺桂自由水/束縛水變化比湖北襄陽天竺桂反應(yīng)較慢，變化幅度較小。游離脯氨酸含量、可溶性蛋白、葉綠素含量變化也能說明這一現(xiàn)象，通過兩個地區(qū)天竺桂葉片對低溫反應(yīng)過程中游離普氨酸、可溶性蛋白、葉綠素含量變化相比，湖北襄陽天竺桂變化較大、含量較高、反應(yīng)敏感，河南欒川天竺桂變化較小、含量較底、反應(yīng)不太敏感，也表明了河南欒川天竺桂抗寒性高于湖北襄陽天竺桂，同時這一實驗結(jié)果與樹種原生地極端最低氣溫和引種試驗田間觀察結(jié)果一致。

綜合各項指標(biāo)表明河南欒川天竺桂葉片耐受低溫為-20℃，湖北省襄陽天竺桂葉片耐受低溫為-16℃。

4 問題與討論

由于不同溫度處理是在低溫程序控制冰箱中進行，相對于田間來說，其降溫速度、恒定時間于田間有很大差異，所以通過自然降溫不同時段采集的實驗材料更能反映數(shù)據(jù)的真實性。

本次抗寒性試驗僅采集天竺桂葉片進行試驗，天竺桂小枝、根部低溫、水分、鹽分脅迫尚未進行，有待進一步研究。

由于此次進行抗寒生理生化測定所使用的葉片為離體葉片，于樹體葉片存在差異，也影響了數(shù)據(jù)的可信程度，今后將利用自然降溫過程采摘樹體葉片進行試驗以獲取最真實的數(shù)據(jù)。

[1]丁寶章，王遂義．河南植物志第2冊[M]. 鄭州：河南科學(xué)技術(shù)出版社，1981.

[2]魏振鐸．欒川縣野生天竺桂資源保護初探[J]．河南林業(yè)科技，2010（02）：26-27．

[3] 趙世杰，史國安，董新純，等. 植物生理學(xué)試驗指導(dǎo)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002.

[4] 葉寶興，朱新產(chǎn). 生物科學(xué)基礎(chǔ)實驗[M]. 北京：高等教育出版社，2007.

[5] THOMASHOW M F. Sowhats new in the field of plant cold acclin ationLots[ J]．Plant Physio，2001，125：89-93．

[6] GLERUM C. Frost hardiness of coniferous seed lings p rinciples and appli cations[M] / DURYEA M L. Evaluating seedl ing quality.princip les，procedures, and predictive abilities of major tests. Corvall is, OR：Forest Reasearch Laborary，Oregon State University, 1985: 107-123．

[7]趙玲玲，宋來慶，劉志，等．低溫脅迫下4種蘋果砧木葉片多胺的變化[J]．果樹學(xué)報，2008，25（2）：151-156．

2014-10-31

S 685.15

A

1003-2630（2014）04-0026-04

（責(zé)任編輯：王團榮）