棗果主要酶活性與棗縮果病的關(guān)系研究

馬俊青，宋宏偉，盧紹輝，袁國(guó)軍，梅象信

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棗果主要酶活性與棗縮果病的關(guān)系研究

馬俊青，宋宏偉，盧紹輝，袁國(guó)軍，梅象信

（河南省林業(yè)科學(xué)研究院，鄭州 450008）

為揭示縮果病的發(fā)生對(duì)棗果和棗葉片中的MDA、PPO、CAT和PAL活性的影響，測(cè)試了發(fā)病與不發(fā)病的棗樹中的葉與果中MDA、PPO、CAT和PAL活性，結(jié)果表明：MDA活性整體式呈上升趨勢(shì)，病葉均大于健葉；在新鄭灰棗棗果中，MDA活性呈下降趨勢(shì)，而且病果均大于健果；在新鄭灰棗中，病果和健果的PPO活性均是上升趨勢(shì)，到完熟期達(dá)到高峰，且病果一直高于健果；在扁核酸中病果的PAL活性一直高于健果。

棗縮果病；酶活性；灰棗；扁核酸

棗縮果病，又稱鐵皮病，主要危害棗果，在果實(shí)白熟期發(fā)病，造成果肉變褐、味苦、提前落果，在河南新鄭、濮陽(yáng)等棗主產(chǎn)區(qū)，縮果病的病果率常達(dá)30%～80%，有的年份甚至絕收，縮果病已成為棗樹生產(chǎn)上亟待解決的難題[1]。造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是我國(guó)各大棗區(qū)的主要病害之一。我國(guó)自正式報(bào)道棗縮果病以來(lái)，在病原、發(fā)生規(guī)律、病害防控等方面取得了一些成果，然而至今對(duì)其病因仍存爭(zhēng)議（前后出現(xiàn)過(guò)9種真菌及2種細(xì)菌單獨(dú)或者混合侵染），藥劑防治效果一直不夠理想。酶普遍存在于生物體內(nèi)，是生物體內(nèi)起催化作用的蛋白質(zhì)。酶活力也稱酶活性是指催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。當(dāng)植物受到侵害時(shí)，植物細(xì)胞中控制物質(zhì)代謝的酶首先做出反應(yīng)[2]，試驗(yàn)采取發(fā)病前與發(fā)病后動(dòng)態(tài)測(cè)試，分析MDA、PPO、CAT和PAL酶活與縮果病關(guān)系。其中PAL 和 PPO 是植物次生代謝過(guò)程的關(guān)鍵酶，與植物的抗病蟲能力緊密相關(guān)。

本研究旨在通過(guò)對(duì)發(fā)病與不發(fā)病的棗樹中的葉與果中MDA、PPO、CAT和PAL活性的測(cè)定，為揭示棗縮果病的發(fā)生原因提供一個(gè)有力的依據(jù)，早日解決棗樹縮果病帶來(lái)的危害。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試樣品為新鄭灰棗和濮陽(yáng)扁核酸。

1.2 采樣方法

①果實(shí)采樣方法。于白熟期、脆熟期、完熟期3個(gè)時(shí)期各采樣1次，共3次。采集病果和健果樣品各15個(gè)果，分成3組，每組樣品5個(gè)果。

②葉片采樣方法。于花期、白熟期、脆熟期、完熟期4個(gè)時(shí)期各采樣1次，共4次。在灰棗和扁核酸中各選取2011年發(fā)病嚴(yán)重樹3株，每株樹采葉樣鮮樣200 g，同時(shí)選取健康樹3棵，每株樹采葉樣鮮樣200 g。采樣回去后，將病葉樣制成3個(gè)混合樣，健康葉樣制成3個(gè)混合樣。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1丙二醛MDA活性測(cè)定[3]

1.3.1.1 酶液提取

稱取樣品0.5 g ，置研缽中，加 2～3 mL 4℃下預(yù)冷的 pH7.8 磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入 25 mL 容量瓶中，并用緩沖液沖洗研缽數(shù)次，合并緩沖洗液，并定容到刻度?；旌暇鶆?，將容量瓶置 5℃冰箱中靜置 l0 min ，取上部澄清液在 10 000 r/min 下離心 15 min ，上清液即為過(guò)氧化氫酶粗提液， 5℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 MDA的測(cè)定

取 l0 mL 試管，依次加入1 mL酶、2 mL0.6%的TBA，封口沸水浴15 min，迅速冷卻后再離心，取上清液。在600、532、450 nm 三個(gè)波長(zhǎng)下比色。

結(jié)果計(jì)算：

/（μmol/gfw）

=（6.45×（D532-D600）-0.56D450）×0.015/W或（6.45×（D532-D600）-0.56D450）×0.03/W

1.3.2多酚氧化酶PPO活性測(cè)定[3]

1.3.2.1 酶液提取

同MDA方法。

1.3.2.2 測(cè)定

在含有4 mL pH5.8的0.2M磷酸氫二鈉－0.1M檸檬酸緩沖液試管中加入0.05 mL 0.05M鄰苯二酚溶液，在30℃恒溫水浴中預(yù)熱后加入0.05 mL酶液，反應(yīng)5 min，在分光光度計(jì)410 nm處讀取吸光值。在上述條件下，以A410讀數(shù)，以每分鐘增加0.01 OD值定義為一個(gè)酶活性單位（U）。

1.3.3過(guò)氧化氫酶{CAT}活性測(cè)定[3]

1.3.3.1 酶液提取同MDA方法。

1.3.3.2 測(cè)定

取 l0 mL 試管，按照50μL酶液、3 mL pH7.8 磷酸緩沖液的順序加入試劑，25℃預(yù)熱后，逐管加入 0.3 mL 0.1 mol/L 的 H2O2，每加完 1 管立即計(jì)時(shí)，并迅速倒入石英比色杯中， 240 nm 下測(cè)定吸光度，每隔 l min 讀數(shù) 1 次，共測(cè) 4 min ，待 3 支管全部測(cè)定完后，計(jì)算酶活性以 1 min 內(nèi) A 240 減少 0.1 的酶量為1個(gè)酶活單位（u）。

1.3.4苯丙氨酸解氨酶{PAL}活性測(cè)定[3]

1.3.4.1 酶的粗提液制備

將采回的樣品每個(gè)樣品各1 g（葉片剪碎，棗果去核切碎）。加入3 mL冷硼酸提取緩沖液（0.1M，pH8.8，1mL EDTA-Na2，1mL DTT）、少量石英砂及約0.1 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），迅速在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中，攪動(dòng)20 min后， 4℃，10 000轉(zhuǎn)/min，離心20 min，上清液即為酶粗提取液，- 4℃保存。

1.3.4.2 酶活測(cè)定

試管中加入0.6 mL硼酸緩沖液（0.05M，pH8.8）、0.1 mL 0.01ML-苯丙氨酸及0.3 mL酶粗提液混勻， 40℃水浴反應(yīng)15 min后，于冰浴中終止反應(yīng)，稀釋5倍后，用惠普6010紫外線-可見分光光度計(jì)在290 nm處測(cè)吸光值，10 min后再測(cè)1次，以每小時(shí)使OD值變化0.01作為1個(gè)酶活力單位U，計(jì)算酶的比活性U/g。以0.3 mL硼酸提取緩沖液（0.1M，pH8.8，含1mL EDTA-Na2，1mL DTT）代替酶粗提液（其余同前試管）為空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

從圖1-8可以看出：MDA活性在灰棗和扁核酸中均為完熟期時(shí)病果大于健果；PPO活性在灰棗和扁核酸中，在花期就已出現(xiàn)病葉大于健葉，并且一直持續(xù)到棗果的完熟期，病果也是一直都高于健果；CAT活性在灰棗和扁核酸中均呈現(xiàn)棗葉在完熟期達(dá)到高峰期，脆熟期為低谷期，棗果是在白熟期病果大于健果；PAL活性在灰棗和扁核酸中棗果的生長(zhǎng)時(shí)期就一直是病果大于健果，并且在脆熟期病果的PAL達(dá)到最高值，在完熟期時(shí)PAL活性降低。

從圖1可以看出：在新鄭灰棗棗葉中，MDA活性整體式呈上升趨勢(shì)，病葉均大于健葉；在新鄭灰棗棗果中，MDA活性呈下降趨勢(shì)，而且病果均大于健果。

從圖2可以看出：在濮陽(yáng)扁核酸棗葉中，健葉的MDA活性整體呈下降趨勢(shì)，而病葉在脆熟期后呈上升趨勢(shì)；在新鄭灰棗棗果中，健果和病果MDA活性均為先上升到脆熟期達(dá)到最高值后又下降趨勢(shì)，并且在完熟期時(shí)，病果和病葉均高于健康的。

圖1 新鄭灰棗MDA活性

圖2 濮陽(yáng)扁核酸MDA活

從圖3可以看出：在新鄭灰棗棗葉中，PPO活性在健葉呈下降趨勢(shì)，且最后趨近于0，而病葉在花期與脆熟期呈現(xiàn)高峰值，且每個(gè)時(shí)期均高于健葉；在新鄭灰棗棗果中，PPO活性基本呈上升趨勢(shì)，而在完熟期到達(dá)高峰，且病果在各個(gè)時(shí)期均大于健果。

從圖4可以看出：在濮陽(yáng)扁核酸棗葉中，PPO活性在病葉中是緩慢上升的趨勢(shì)，健葉在花期、白熟期和完熟期的PPO的活性均低于病葉；在濮陽(yáng)扁核酸棗果中，病果和健果的PPO活性均是上升趨勢(shì)，到完熟期達(dá)到高峰，且病果一直高于健果。

圖3 新鄭灰棗PPO活性

圖4 濮陽(yáng)扁核酸PPO活性

從圖5可以看出：在新鄭灰棗棗葉中，病葉和健葉的CAT活性在完熟期出現(xiàn)峰值，花期和脆熟期是低谷；在新鄭灰棗棗果中，白熟期病果高于健果。

從圖6可以看出：在濮陽(yáng)扁核酸棗葉中，在脆熟期出現(xiàn)低谷，完熟期達(dá)到峰值，在花期健葉大于病葉；在濮陽(yáng)扁核酸棗果中，白熟期病果高于健果。

圖5 新鄭灰棗CAT活性

圖6 濮陽(yáng)扁核酸CAT活性

從圖7可以看出：在新鄭灰棗棗葉中，PAL活性總體呈先上升后下降的趨勢(shì)，健葉在白熟期出現(xiàn)高峰，病葉則在脆熟期出現(xiàn)高峰，在花期和白熟期健葉高于病葉，在脆熟期和完熟期病葉高于健葉。在新鄭灰棗棗果中，健果和病果的PAL活性均在脆熟期有小的高峰，且病果一直高于健果。

從圖8可以看出：在濮陽(yáng)扁核酸棗葉中，整體呈下降趨勢(shì)，并且在花期健葉的PAL活性達(dá)到峰值。在濮陽(yáng)扁核酸棗果中，病果的PAL活性一直高于健果。

圖7 新鄭灰棗PAL活性

圖8 濮陽(yáng)扁核酸PAL活性

3 結(jié)論與討論

MDA是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)而產(chǎn)生的氧化終產(chǎn)物，MDA會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性。MDA活性在完熟期時(shí)病果大于健果，原因可能是在棗果患病的過(guò)程中，機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)造成的脂質(zhì)過(guò)度發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，使MDA升高，并且到完熟期表現(xiàn)出來(lái)，這也是積累效應(yīng)導(dǎo)致的結(jié)果，當(dāng)植物機(jī)體的還原性與氧化性打破平衡，最終氧化產(chǎn)物占優(yōu)勢(shì)時(shí)，也就表現(xiàn)出MDA活性在病果中高于健果。

PPO與抗病性的關(guān)系人們已進(jìn)行了廣泛的研究。植物在抵御病原微生物的侵染過(guò)程中，抗性相關(guān)酶發(fā)揮了重要作用，這主要包括了酚類代謝系統(tǒng)中的一些酶和病原相關(guān)蛋白家族PPO通過(guò)催化木質(zhì)素及醌類化合物形成，構(gòu)成保護(hù)性屏蔽而使細(xì)胞免受病菌的侵害，也可以通過(guò)形成醌類物質(zhì)直接發(fā)揮抗病作用。在試驗(yàn)中，從花期開始就有病葉的PPO活性高于健葉，這說(shuō)明在花期就已經(jīng)有病原微生物侵染的棗樹，并且整個(gè)果實(shí)成長(zhǎng)期也是病果在任何時(shí)期PPO活性高于健果。PPO作為抗性酶在抵御病原微生物的侵染過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

CAT是一種酶類清除劑，又稱為觸酶，是以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶。它可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內(nèi)的過(guò)氧化氫，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。CAT活性在白熟期病果大于健果，而在脆熟期和完熟期，健果大于病果，可能是棗果在脆熟期前后對(duì)病原產(chǎn)生一定的作用，灰棗葉中的表現(xiàn)和棗果表現(xiàn)一致。出現(xiàn)這一現(xiàn)象，則具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

PAL是植物次生物質(zhì)代謝系統(tǒng)中比較關(guān)鍵的一個(gè)酶，是苯丙烷類代謝途徑即酚類物質(zhì)、植保素、黃酮和木質(zhì)素等抗菌物質(zhì)合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶和限速酶，PAL活性的高低直接決定以后一系列次生物質(zhì)合成步驟中生物活性的高低，所以PAL被認(rèn)為對(duì)植物的抗病性是十分有利的。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，病果中的PAL活性一直高于健果，且呈上升趨勢(shì)，這也表明在果實(shí)成長(zhǎng)期間一直有病原微生物侵染棗樹，并且隨著果實(shí)的生長(zhǎng)過(guò)程有加大的趨勢(shì)，這種現(xiàn)象可能是由于在果實(shí)生長(zhǎng)期隨著果實(shí)的生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)越來(lái)越多地供給到果實(shí)，而棗樹的其他器官出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不良，樹勢(shì)衰弱導(dǎo)致的。隨著病原微生物的侵染，PAL有逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，到脆熟期達(dá)到了最高值，隨著果實(shí)的成熟，樹體就不需在大量供給營(yíng)養(yǎng)到果實(shí)上，樹勢(shì)就會(huì)慢慢增強(qiáng)，此時(shí)的PAL活性就會(huì)降低。由此可推斷出：縮果病可能是由于樹勢(shì)衰弱而抵抗不了病原微生物的侵染而導(dǎo)致的，并且導(dǎo)致棗縮果病的這個(gè)病原微生物有可能是弱寄生菌。

[1]張朝紅，劉孟軍，孔得倉(cāng)，等. 棗種質(zhì)縮果病抗性多樣性研究[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2011（04）：13-14.

[2]張欣. 與植物抗病性有關(guān)酶的研究進(jìn)展[J]. 華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000（01）：46.

[3] 張樹生，胡蕾，劉忠良，等. 植物體內(nèi)抗病相關(guān)酶與植物抗病性的關(guān)系[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006（13）： 1 349-1 350.

2014-12-15

林業(yè)公益性科研專項(xiàng)“棗樹重大病蟲害防治及優(yōu)質(zhì)商品棗安全生產(chǎn)技術(shù)研究”（201104017）

馬俊青（1979-），女，河南鄭州人，工程師，主要從事森林病蟲害、生態(tài)方面的研究。E-mail:：27298191@qq.com

S 665.1

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1003-2630（2014）04-0007-04

（責(zé)任編輯：王團(tuán)榮）