血管緊張素（1～7）對2型糖尿病大鼠胰島形態(tài)及功能的影響

王 麗，何軍華，吳慧璐，程 瑞，范運娟

研究表明，胰腺中表達腎素－血管緊張素系統(tǒng)（RAS），阻斷腎素－血管緊張素系統(tǒng)可減少糖尿病的發(fā)生率。近年來發(fā)現(xiàn)了腎素－血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的生理拮抗劑血管緊張素（1～7）［Ang（1～7）］。本研究通過Ang（1～7）干預(yù)，探討在整體狀態(tài)下阻斷腎素－血管緊張素系統(tǒng)對2 型糖尿?。═2DM）大鼠胰島形態(tài)、功能及胰腺局部氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 180g～220g 雄性清潔級Wistar大鼠36只，普通標準飼料（由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供）喂養(yǎng)2周，測體重。隨機選取12只為正常對照（NC）組，普通飼料喂養(yǎng)。24 只予以高糖高脂飼料（10%豬油、10%蛋黃、20%蔗糖、60%普通標準飼料）喂養(yǎng)，8 周后一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）40mg／kg（STZ以0.1mol／L、pH4.4的檸檬酸鈉緩沖液配置）制作T2DM 模型。正常對照組以普通飼料喂養(yǎng)8周后腹腔注射等量的檸檬酸鈉緩沖液。1周后尾靜脈采血測空腹血糖（FBG），非同日兩次FBG≥16.7mmol／L 且觀察期間血糖未出現(xiàn)明顯下降為T2DM 模型制作成功，共20只，隨機分為糖尿病對照（D0）組、Ang（1～7）［300μg／（kg·d）］干預(yù)（D1）組，每組10只。D0組以等量的生理鹽水頸部皮下注射，連續(xù)8周，仍以高糖高脂飼料喂養(yǎng)。

1.2 實驗方法及檢測指標

1.2.1 大鼠體重、血糖濃度的測定 分別于飼養(yǎng)前、STZ注射前后每周用電子秤測體重（武漢自動化儀表廠生產(chǎn)），并分批進行大鼠尾靜脈采血（采血前大鼠禁食10h）測血糖濃度（美國強生血糖儀）。

1.2.2 蘇木精伊紅（HE）染色進行胰腺病理形態(tài)學觀察 實驗?zāi)└鹘M大鼠用25%烏拉坦麻醉，腹主動脈采血后，迅速摘取完整的胰腺組織，置于冰冷的PBS液中漂洗，除去血液并仔細分離多余的脂肪組織。取相同部位的胰腺組織做石蠟切片，每個蠟塊切片5張，用二甲苯脫蠟、梯度酒精復(fù)水后用蘇木精和伊紅染色，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在Olympus光學顯微鏡高倍（×400）視野下定性觀察，胰島內(nèi)細胞數(shù)目，細胞的形態(tài)，細胞膜的完整性，細胞核的大小、形態(tài)。

1.2.3 免疫組織化學指標檢測 將胰腺組織放入4%多聚甲醛中固定48h，再依次脫水、透明、浸蠟、包埋及切片，采用免疫組織化學染色，在Olympus光學顯微鏡下觀察，胞漿染色呈褐色顆粒者視為陽性表達。每個指標各切5張，將每張切片隨機編號，在高倍（×400）下雙盲觀察6個～8個視野，選擇胰島部分用計算機圖像處理系統(tǒng)進行平均光密度檢測，并量化分析。

1.2.4 血清AngⅡ及胰島素水平的測定 STZ注射9周后，25%烏拉坦麻醉大鼠，腹主動脈采血2mL 靜置后，3 000r／min離心10min，取上清液－70 ℃冰箱保存。大鼠AngⅡ及胰島素均嚴格按照其ELISA 試劑盒說明操作。

1.2.5 穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（Homa－IR）測定運用李 光 偉 法［1］，Homa－IR＝（FBG×FINS）／22.5，F(xiàn)INS為空腹胰島素。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差）表示。組間差異采用單因素方差分析，組間均值比較采用LSD 法，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠胰腺胰島細胞HE 染色形態(tài)學觀察結(jié)果 從HE 染色病理切片可見NC 組大鼠胰島呈圓形，胰島細胞排列規(guī)律，呈索狀排列，胰島細胞胞質(zhì)淺染呈粉紅色，胞核密集，竇隙血管腔大。D0組胰島細胞排列稀疏不均，細胞形態(tài)不一，大部分細胞核淡染，胞漿疏松呈空網(wǎng)狀，胞漿淡染，不清晰，梁索間的竇隙血管腔明顯變小，部分處于近乎閉塞狀態(tài)。D1組胰島細胞排列不整齊，大鼠胰島β細胞體積增大，核染色質(zhì)清晰，胞漿豐富，呈淡紅染細顆粒狀，竇隙血管腔變小。

2.2 胰島免疫組化結(jié)果

2.2.1 胰島素免疫組化染色分析 與NC 相比，D0組β細胞內(nèi)胰島素相對濃度（IRC）顯著下降（P ＜0.01），表明D0組大鼠胰島素貯備不足。干預(yù)后，D1組與D0組比較，細胞內(nèi)胰島素相對濃度有所增加（P ＜0.05）。詳見表1。

2.2.2 胰島內(nèi)誘導(dǎo)型NO 合酶（iNOS）表達水平 與NC相比，D 0組胰｛JP 3島iNOS相對濃度顯著增加（P ＜0.01），增加了43.5%；D1組iNOS表達較D0組顯著降低（P ＜0.05），降低了19.4%，但仍較NC 組高（P ＜0.01）。詳見表1。

表1 各組大鼠胰島免疫組化結(jié)果量化分析

表1 各組大鼠胰島免疫組化結(jié)果量化分析

與NC組比較，1）P ＜0.01；與D0組比較，2）P ＜0.05。

組別 n IRC iNOS NC組 12 0.47±0.03 0.35±0.03 D0組 10 0.22±0.011） 0.62±0.041）D1組 10 0.34±0.012） 0.50±0.052）

2.3 Ang（1～7）對大鼠血糖、體重的影響（見表2）干預(yù)結(jié)束后與D0組相比，D1組大鼠體重差異無統(tǒng)計學意義，但D0組、D1組體重均低于NC組（P ＜0.01）。STZ注 射 后 第9 周 末，與NC 組 比 較，D1 組、D0 組FBG 明顯升高（P ＜0.01），與D0組比較，D1組FBG有所降低（P ＜0.05）。

2.4 大鼠血清AngⅡ及胰島素含量的變化（見表2）

2.4.1 大鼠血清AngⅡ的表達水平 與NC 組相比，D0組血清AngⅡ含量明顯升高（P ＜0.01），與D0組相比，D1組AngⅡ水平顯著降低（P ＜0.05）。

2.4.2 大鼠血清胰島素含量的變化 造模9周后，與NC組相比，D 0組與D 1組血清胰島素均明顯降低（P＜0.01）；與D0組相比，D1組血清胰島素增加（P＜0.05）。

2.5 Homa－IR 的變化（見表2） 造模9周后，與NC組相比，D 0組與D 1組血清Homa－IR均明顯增加（P＜0.01），與D0組相比，D1組血清Homa－IR降低（P ＜0.05）。

表1 干預(yù)后各組大鼠FBG、FINS、Homa－IR、AngⅡ的比較

表1 干預(yù)后各組大鼠FBG、FINS、Homa－IR、AngⅡ的比較

與NC組比較，1）P ＜0.01；與D0組比較，2）P ＜0.05。

組別 n 體g重mmol／L mIU／L Homa－IR ng／mⅡL NC組 12 331.8±14.5 5.43±0.50 15.73±1.43 3.78±0.39 2.72±0.13 D0組 10 234.6±15.01） 19.60±1.311） 8.01±1.131） 6.98±1.011） 3.70±0.191）D1組 10 231.3±10.61） 13.03±0.801）2） 10.65±0.841）2） 6.17±0.691）2） 3.47±0.111）2）

3 討 論

近年來T2DM 與RAS 系統(tǒng)關(guān)系備受關(guān)注。T2DM 是一種慢性進展性疾病，胰腺β細胞功能缺陷是其發(fā)生發(fā)展的主要病理生理學特征。胰腺中存在局部的RAS［2］及RAS中新的物質(zhì)如Ang4、Ang（1～7）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）新的受體Mas。其中Ang（1～7）是由天冬氨酸、精氨酸、纈氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、組氨酸、脯氨酸組成的七肽。AngⅡ在ACE2的催化下生成Ang（1～7），一方面降低了AngⅡ的含量，另一方面其催化產(chǎn)物Ang（1～7）與受體Mas結(jié)合可起到拮抗AngⅡ的作用，即舒張血管、抗炎、抗組織纖維化、抗氧化應(yīng)激等［3，4］，Ang（1～7）參與幾乎所有RAS系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機制［5，6］。有研究表明，Ang（1～7）－Mas受體軸可能參與糖耐量異常和胰島素抵抗的發(fā)生［7］，但其在胰島中的具體作用機制尚不明確。長期高血糖狀態(tài)可使局部RAS活性增強，RAS 活化后可通過誘導(dǎo)細胞凋亡、增強氧化應(yīng)激及血流動力學的改變等引起胰島結(jié)構(gòu)和功能進一步損害。本研究采用高糖高脂飼料加小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射建立T2DM 大鼠模型，發(fā)現(xiàn)T2DM 大鼠血清AngⅡ增加，胰島形態(tài)較正常對照組明顯異常，細胞內(nèi)胰島素分泌顆粒減少，胰島功能下降，胰島素抵抗指數(shù)增加。通過Ang（1～7）干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，阻斷RAS可改善胰島細胞的形態(tài)、增加胰島β細胞內(nèi)胰島素的分泌顆粒，改善胰島素抵抗。提示胰島素分泌減少可能與長期胰島素抵抗作用下胰島β細胞受損有關(guān)，胰島β細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變必將影響胰島功能。RAS的活化也可能參與了T2DM 大鼠胰島形態(tài)和功能的損傷，給予AngⅡ生理拮抗劑Ang（1～7）后降低T2DM 大鼠FBG 的同時明顯改善其胰島的形態(tài)和提高β 細胞胰島素的儲備，進一步改善T2DM 大鼠胰島素抵抗水平。

胰島β細胞的凋亡和功能障礙與T2DM 有密切關(guān)系［8］。經(jīng)典的RAS通路ACE－AngⅡ－AT1過度激活，可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，影響細胞能量代謝，導(dǎo)致細胞凋亡。以往的研究證實，RAS阻斷可保護胰島β細胞免受氧化應(yīng)激損害，進而改善胰島素的合成和分泌。iNOS在氧化應(yīng)激中起到重要作用，胰島局部iNOS表達增加可導(dǎo)致NO 水平增加從而使氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，可引起胰島β細胞功能下降及β細胞凋亡信號被大量激活。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，T2DM 大鼠胰島iNOS水平升高，通過阻斷RAS后，胰島局部iNOS減少。因此推測糖尿病狀態(tài)下拮抗RAS后，減少了局部的氧化應(yīng)激水平，減輕了炎癥反應(yīng)，減少了炎癥因子的表達，有利于胰島氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，進而減少了β細胞的損害及凋亡，進一步改善了胰島形態(tài)和β細胞功能。

本研究從形態(tài)學和功能學的角度初步證實Ang（1～7）干預(yù)可改善T2DM 大鼠胰島形態(tài)，優(yōu)化胰島功能，減少胰島局部氧化應(yīng)激。表明胰腺局部RAS的活化在T2DM 的發(fā)展過程中起到重要作用，為臨床糖尿病患者胰島β細胞的保護提供了新的靶點，但Ang（1～7）與胰島β細胞形態(tài)和功能的關(guān)系及其具體分子機制還待進一步研究。

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