P13K－Akt信號(hào)通路在七氟醚預(yù)處理減輕大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用1）

楊華麗，韓沖芳，周曉輝，雒 珉，王曉鵬，張建文，張衛(wèi)衛(wèi)

腦缺血再灌注損傷可引起腦細(xì)胞凋亡。蘇氨酸激酶／磷脂酰肌醇－3激酶－絲氨酸（P13K－Akt）是參與細(xì)胞增殖分化、抑制細(xì)胞凋亡，是細(xì)胞生存的一種重要信號(hào)通路之一［1］。研究表明，七氟烷預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，而這種保護(hù)機(jī)制尚不完全明確［2，3］。本實(shí)驗(yàn)研究P13K－Akt信號(hào)通路來(lái)評(píng)價(jià)七氟烷預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年雄性SD 大鼠40只，體重220g～280g（山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），按隨機(jī)數(shù)字法，隨機(jī)分為5組（n＝8）：假手術(shù)組（C 組）、缺血再灌注組（IR 組）、七氟烷預(yù)處理組（S組）、七氟烷預(yù)處理＋抑制劑LY294002（S＋LY組）、溶劑組（DMSO 組）。

1.2 模型制備及分組處理 采用夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈法制備腦缺血再灌注模型。大鼠稱重，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，經(jīng)口氣管插管，接ALC－V8小型動(dòng)物呼吸機(jī)（上海奧爾特生物科技有限公司）行機(jī)械通氣，潮氣量為（5～7）mL／kg，頻率為60次／min，吸純氧，流量為2L／min，吸呼比1∶2。大鼠仰臥固定，頸前正中切開逐層分離，暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，然后用無(wú)創(chuàng)微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈20 min，松開動(dòng)脈夾后恢復(fù)腦血流灌注，搏動(dòng)恢復(fù)為建模成功。C組只分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈；IR 組夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈缺血20 min，再灌注24h；S組、S＋LY 組、DMSO組在缺血前60min分別經(jīng)七氟烷揮發(fā)罐（Aeommed vp3000）吸入2.4%七氟烷（sevoflurane，H20060586，丸石制藥株式會(huì)社）、2.4%七氟烷＋側(cè)腦室注入抑制劑LY294002（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，溶于DMSO 中，0.3 mg／kg）8μL、側(cè)腦室注入DMSO 8μL，缺血20min，再恢復(fù)灌注24h。

1.3 標(biāo)本采集 各組24h灌注結(jié)束后取海馬組織，置于10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE 染色，光鏡下（×400）觀察各組病理學(xué)變化。

1.4 磷酸化Akt（p－Akt）的檢測(cè) 采用免疫組化法（PV－6001二步法，試劑購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）檢測(cè)p－Akt的活性（p－Akt多克隆抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。光鏡下p－Akt陽(yáng)性胞漿呈現(xiàn)黃棕色，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算平均光密度值（OD 值），作為評(píng)價(jià)陽(yáng)性產(chǎn)物指標(biāo)。

1.5 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) TUNEL 法檢測(cè)腦細(xì)胞凋亡，檢測(cè)程序按照TUNEL試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明書進(jìn)行。隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比（陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞核呈現(xiàn)棕色顆粒），所得指數(shù)即為凋亡指數(shù)（AI）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用統(tǒng)計(jì)學(xué)SPSS17.0軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間行單因素方差分析，兩兩之間采用SNK 法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠腦細(xì)胞凋亡指數(shù) AI及海馬組織P－Akt表達(dá) 與C組比較，余4組凋亡指數(shù)AI及磷酸化Akt 表達(dá)均增加（P ＜0.0 5）。同IR組比較，S組凋亡指數(shù)AI表達(dá)降低明顯（P ＜0.05），磷酸化Akt表達(dá)增加（P＜0.05），S＋LY 組和DMSO 組各指標(biāo)變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與S 組相比，S＋LY 組與DMSO 組凋亡指數(shù)AI表達(dá)明顯增加，磷酸化Akt表達(dá)降低顯著（P＜0.05）。詳見表1。

表1 大鼠腦細(xì)胞凋亡指數(shù)AI及海馬組織P－Akt表達(dá)

表1 大鼠腦細(xì)胞凋亡指數(shù)AI及海馬組織P－Akt表達(dá)

與C組比較，1）P＜0.05；與IR 組比較，2）P＜0.05；與S組比較，3）P＜0.05。

組別 AI P－Akt C組 1.547±0.792 0.141±0.020 IR 組 38.595±4.0041） 0.268±0.0511）S組 26.793±4.4411）2） 0.347±0.0521）2）S＋LY 組 39.973±6.8101）3） 0.270±0.0591）3）DMSO 組 38.461±2.7031）3） 0.280±0.0331）3）

2.2 各組海馬組織光鏡觀察 C組神經(jīng)元細(xì)胞分布均勻，形態(tài)正常，核圓形或橢圓形，核仁清楚可見。IR 組、S＋LY 組及DMSO 組腦細(xì)胞排列分布稀疏紊亂，數(shù)目減少，胞核固縮或溶解，邊界模糊不清，核仁模糊，凋亡細(xì)胞增多。S組腦神經(jīng)元細(xì)胞排列稍不整齊，大部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚清晰，細(xì)胞損傷輕微。

3 討 論

有研究顯示，選擇2.4%的七氟烷濃度進(jìn)行研究，以?shī)A閉雙側(cè)頸動(dòng)脈法制備大鼠腦缺血再灌注模型［4，5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與S組比較，IR 組AI值升高顯著，p－Akt降低顯著，海馬組織病理學(xué)損傷明顯，提示腦缺血再灌注損傷模型制備成功。

大鼠腦海馬區(qū)神經(jīng)元對(duì)腦缺血反應(yīng)較敏感，表現(xiàn)為細(xì)胞的凋亡、壞死，最終導(dǎo)致神經(jīng)元數(shù)目減少，進(jìn)而影響生物學(xué)功能［6］，因此選其作為研究對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)中，以凋亡指數(shù)AI來(lái)評(píng)價(jià)海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞損傷情況，IR 組細(xì)胞損傷嚴(yán)重，AI顯著增高，S組AI降低明顯，細(xì)胞壞死損傷輕微，說(shuō)明七氟烷預(yù)處理能有效減少細(xì)胞凋亡，對(duì)腦缺血再灌注損傷起到一定的保護(hù)作用。

PI3K 是一種聯(lián)系胞外信號(hào)與細(xì)胞應(yīng)答的橋梁分子，在上游或旁路信號(hào)分子的影響下，通過(guò)活化下游的多種效應(yīng)分子，并作用于下游分子而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期運(yùn)行以及抑制細(xì)胞的凋亡［7］，而Akt是PI3K 下游重要的效應(yīng)介質(zhì)之一，是該通路的中心樞紐和直接靶點(diǎn)，直接傳遞著PI3K 的信息［8］，Akt磷酸化激活后，增加NOS生成、抑制下游凋亡蛋白Caspase－9 等的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡 蛋 白Bcl－2等 的 表 達(dá) 而 發(fā) 揮 抗 凋 亡 作 用［9，10］，因 此，PI3K－Akt信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的增殖和存活起著重要的作用［11］。研究表明，心肌缺血再灌注時(shí)，活化的Akt可以防止細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的存活，減輕缺血再灌注損傷［12］。本研究結(jié)果顯示，與IR 組比較，S組P－Akt表達(dá)增加，使用PI3K 特異性抑制劑LY294002后，P－Akt表達(dá)下調(diào)，七氟烷保護(hù)效應(yīng)消失，提示PI3K－Akt信號(hào)通路介導(dǎo)了七氟烷預(yù)處理減輕腦缺血再灌注損傷中的作用。七氟烷預(yù)處理可通過(guò)激活PI3K／Akt信號(hào)通道而發(fā)揮減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。

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