亞低溫干預(yù)下新生大鼠缺氧缺血性腦損傷腦組織Bax基因表達(dá)變化及意義1）

李迎敏，陰懷清，栗 紅，張 巍，張曉佳，馮鈺淑，張 新

新生兒缺氧缺血性腦損傷（HIBD）所致神經(jīng)元損傷主要有壞死和凋亡兩種方式。缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF－1）、Bcl－2、Bax等分子共同參與和調(diào)節(jié)由缺氧引起的凋亡。生理或病理缺氧狀態(tài)下HIF－1對維持機(jī)體氧平衡有重要作用［1－3］，可通過作用于下游靶基因以減少Bax［4］等促凋亡因子。近年來的實(shí)驗(yàn)研究表明亞低溫干預(yù)是治療HIBD 最具有前途的措施之一［5－8］。亞低溫干預(yù)可抑制并減少HIBD 所引起的神經(jīng)元凋亡［9，10］，對HIBD起到重要腦保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 模型制作 新生7日齡Sprague－Dawley清潔級大鼠120只，由山西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，雌雄不拘，體重10g～15g。HIBD 模型制備參照Rice［11］方法，大鼠采用乙醚麻醉后，分離出左頸總動脈并永久結(jié)扎，假手術(shù)動物僅分離出左側(cè)頸總動脈，不予結(jié)扎，術(shù)后回籠恢復(fù)2h，再將鼠放入37℃水浴箱內(nèi)的低氧箱中，箱底鋪鈉石灰以吸收二氧化碳，通入8%氧氣和92%氮?dú)獾幕旌蠚?，于出氣孔檢測氧濃度（Y－12C 型數(shù)字測氧儀，上?？等A生化儀器制造有限公司），2h后開蓋，在箱內(nèi)與空氣接觸并恢復(fù)15min。

1.2 亞低溫實(shí)施及實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)動物采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)分為3組：假手術(shù)組（A 組，肛溫37℃，n＝40）假手術(shù)動物，缺氧缺血組（B組，肛溫37 ℃，n＝40），模型制備完成后籠內(nèi)母乳喂養(yǎng)，亞低溫干預(yù)組（C組，肛溫33 ℃，n＝40），模型制備完畢將動物放入半導(dǎo)體可調(diào)恒溫水浴箱（溫控范圍10 ℃～50 ℃上海理工大學(xué)制冷工程研究所研制）的暖箱內(nèi)（34℃），維持至亞低溫結(jié)束，期間采用配方奶粉喂養(yǎng)［12］。其中各組又根據(jù)處死動物的時間（HIBD 后2h，6h，12h，24h，48h，）隨機(jī)分為5個亞組，每個亞組8只。

1.3 行為及腦組織標(biāo)本外觀觀察 實(shí)驗(yàn)動物置于缺氧環(huán)境中肉眼觀察有無異常行為改變；采用斷頭法處死動物后，觀察缺血側(cè)與對側(cè)腦組織外觀形態(tài)的改變。

1.4 Bax mRNA 表達(dá)的測定 取缺血側(cè)腦組織，按Trizol試劑說明提取腦組織總RNA；采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA；以cDNA 為模板，采用Real－time基因擴(kuò)增儀（西安天隆科技有限公司）進(jìn)行PCR 擴(kuò) 增，內(nèi) 參β－actin上 游 引 物5′－gtc agg tca tca cta tcg gca at－3′，下游引物5′－agaggt ctt tac gga tgt caa cgt－3′；Bax上游引物5′－tgc agagga tga ttg ctg ac－3′，下游引物5′－gat cag ctc ggg cac ttt ag－3′（兩者均由上海生物工程技術(shù)有限公司合成）。RT－PCR操作按試劑盒說明進(jìn)行。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10min，活化Tag酶；94 ℃變性15s，60 ℃退火60s，72 ℃延伸30s，45個循環(huán)結(jié)束；PCR 產(chǎn)物以熒光TaqMan的方法檢測。計(jì)算2－ΔΔCT［13］值反映目的基因表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。根據(jù)正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果，多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 行為觀察 實(shí)驗(yàn)前新生大鼠無行為異常的表現(xiàn)。置于缺氧環(huán)境中的新生大鼠，全部發(fā)生不同程度的異常行為改變，主要表現(xiàn)為：前期出現(xiàn)煩躁、多動、呼吸加深加快、全身紫紺，中期站立不穩(wěn)、全身不斷抖動、有時會出現(xiàn)夾尾左旋，后期煩躁消失，活動減少明顯，出現(xiàn)淡漠、激惹，部分可能出現(xiàn)驚厥。假手術(shù)組行為能力正常。

2.2 腦組織標(biāo)本外觀 假手術(shù)組新生大鼠腦標(biāo)本外觀正常，左右對稱；缺氧缺血組腦組織：2h肉眼觀無明顯改變，6h、12h缺血側(cè)標(biāo)本出現(xiàn)輕微的腦含水量增多，24h～48h出現(xiàn)明顯的腦含水量增多，大小不等，缺血側(cè)腦組織變小、萎縮；亞低溫組雙側(cè)腦組織大小基本正常，無明顯水腫、萎縮。

2.3 各組腦組織Bax mRNA 表達(dá)的比較（見表1）

表1 各組腦組織Bax mRNA 表達(dá)的比較（2－ΔΔCT）

3 討 論

HIBD 發(fā)生以凋亡為主的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡。一般認(rèn)為，凋亡是一個需要能量的主動細(xì)胞死亡過程，具有階段性和程序性，在一定的條件下可逆，因此在凋亡的可逆階段抑制及減少缺氧缺血后神經(jīng)元的過度凋亡，可作為腦損傷干預(yù)的重要措施之一。HIBD 誘發(fā)的細(xì)胞毒性物質(zhì)作用于腦組織細(xì)胞，通過誘導(dǎo)前凋亡蛋白基因P53表達(dá)，使BH3－only蛋白通過間接激活模式［14，15］活化促凋亡分子Bax，Bax／Bcl－2的比例出現(xiàn)失衡，促凋亡分子Bax在線粒體膜上形成寡聚物，可促使線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（PTP）開放，而PTP可作為線粒體的刺激感受器接受有關(guān)受體信號，包括膜間隙的腺嘌呤核苷酸信號和外膜的電位依賴性離子通道信號。PTP的開放會形成正反饋擴(kuò)大過程，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)的破壞及其功能的紊亂，包括滲透壓改變及失衡、線粒體外基質(zhì)內(nèi)流、細(xì)胞器發(fā)生腫脹，致使線粒體的內(nèi)外膜依次裂解，釋放出含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）蛋白激酶，進(jìn)而激活caspase，凋亡信號的正反饋?zhàn)饔帽患壜?lián)放大，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)經(jīng)亞低溫（32 ℃～34 ℃）干預(yù)的新生大鼠，缺血側(cè)腦組織水腫程度較缺氧缺血組明顯降低，且Bax mRNA 的表達(dá)在假手術(shù)組表達(dá)無明顯變化；在缺氧缺血組2h即出現(xiàn)上升，12h達(dá)高峰，12h～48h維持在高峰；亞低溫干預(yù)組各時間點(diǎn)Bax mRNA 的表達(dá)水平較缺氧缺血組明顯降低：2h出現(xiàn)輕微上升，6h出現(xiàn)下降并達(dá)到最低水平，充分證實(shí)了亞低溫干預(yù)可以減少缺血側(cè)Bax mRNA 的表達(dá)，從而降低腦組織細(xì)胞的凋亡，延長損傷細(xì)胞存活時間，對HIBD 的腦組織具有確切的保護(hù)作用。然實(shí)驗(yàn)后期即HIBD 后12h～48h，Bax 基因的表達(dá)出現(xiàn)微升高，其可能作用機(jī)制為亞低溫干預(yù)可上調(diào)HIF－1αmRNA 在腦組織的表達(dá)并延長其表達(dá)的時程［16］，而引起具有保護(hù)作用的基因表達(dá)［17－19］。HIF－1α與p53結(jié)合，使p53穩(wěn)定并發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)，即誘導(dǎo)Bax mRNA 表達(dá)微上調(diào)，下調(diào)Bcl－2，Bax／Bcl－2的比例增加，促進(jìn)細(xì)胞凋亡以清除不適應(yīng)缺氧缺血的細(xì)胞。

Bax參與了新生大鼠HIBD，同時亞低溫干預(yù)能明顯降低腦組織Bax mRNA 表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，清除不適應(yīng)缺氧缺血的細(xì)胞，對HIBD 后的腦組織具有肯定的保護(hù)作用。

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