比索洛爾對(duì)高血壓左室肥大大鼠心肌細(xì)胞GRK2表達(dá)的影響1）

趙 婷，危小良，林岫芳，黃 茵，王成山

高血壓左心室肥厚是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因子，高血壓導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大、心臟重塑，最終導(dǎo)致心力衰竭、心源性死亡的發(fā)生，心衰引起機(jī)體交感神經(jīng)的緊張性增強(qiáng)，β受體密度和功能下調(diào)，G 蛋白受體激酶2（GRK2）的表達(dá)和酶活性增強(qiáng)［1］，且在肥大心肌亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)GRK2 的重新定位［2］，說(shuō)明GRK2可能參與了心肌肥大時(shí)心肌細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)。有研究報(bào)道β受體阻滯劑影響改變心肌中GRK2的表達(dá)和活性，但缺少對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)GRK2的分析［3，4］。本研究檢測(cè)比索洛爾干預(yù)自發(fā)性高血壓心力衰竭大鼠（SHR）左心室心肌細(xì)胞中GRK2的表達(dá)及其亞細(xì)胞分布，探討比索洛爾抑制心臟肥大的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 6月齡Wister－Kyoto（WKY）大鼠，6月、8月齡SHR 大鼠和6月齡藥物組SHR 大鼠，予喂養(yǎng)2個(gè)月的比索洛爾2.5mg／（kg·d）至8月齡（8M－SHR－D組），各組大鼠數(shù)為12只，均購(gòu)買于成都達(dá)碩科技有限公司，藥物放于水槽中讓大鼠飲入。兔抗GRK2（C－15）單克隆抗體、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記雞抗兔抗體、Alexa Flour 488標(biāo)記?？雇每贵w、Luminal發(fā)光試劑盒均購(gòu)買于美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)公司，磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑均購(gòu)買于美國(guó)Sigma公司，膜蛋白抽取試劑盒購(gòu)買于美國(guó)Pierce公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟 ①左心室組織分別提取為總蛋白、胞漿蛋白、核蛋白和膜蛋白，然后分別取這4 種蛋白上樣量25μg，應(yīng)用SDS－PAGE電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)到NC 膜上，X 線膠片曝光記錄；②將左心室冰凍切片成厚6μm 的組織片，行GRK2免疫熒光標(biāo)記，并在熒光顯微鏡下觀察，將其結(jié)果與Western－Blot結(jié)果做比較。上述方法具體步驟參照文獻(xiàn)進(jìn)行［5］。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠左心室重量比較 與6M－WKY組相比，6M－SHR組的心臟重量、心臟重量與體重比以及左心室重量均明顯增加（P ＜0.05）。8M－SHR 組三項(xiàng)心臟重量指標(biāo)進(jìn)一步增加，與6M－SHR組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與8M－SHR組相比，8M－SHR－D 組能使3項(xiàng)心臟重量指標(biāo)明顯減少（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心臟重量指標(biāo)比較

表1 各組大鼠心臟重量指標(biāo)比較

與6M－WKY 組比較，1）P＜0.05；與6M－SHR 組比較，2）P＜0.05；與8M－SHR 組比較，3）P＜0.05。

組別 n 心臟重量（g）心臟重量／體重（%）左心室重量（g）6M－WKY 組 12 0.78±0.03 0.31±0.02 0.39±0.02 6M－SHR 組 12 1.06±0.041） 0.36±0.011） 0.62±0.041）8M－SHR 組 12 1.21±0.072） 0.38±0.022） 0.69±0.032）8M－SHR－D組 12 0.96±0.043） 0.30±0.023） 0.52±0.023）

2.2 GRK2 在心肌組織總蛋白中表達(dá) 與6M－WKY 相比，6M－SHR心肌組織中GRK2 的表達(dá)無(wú)明顯變化（P ＞0.05）。8M－SHR心肌組織中GRK2的表達(dá)顯著增加，高于6M－SHR 組和6M－WKY 組（P ＜0.05）。比 索 洛 爾 干 預(yù) 后 的8M－SHR－D組心肌組織中GRK 2的表達(dá)顯著減少，均低于8M－SHR組（P＜0.05），但高于6M－SHR組和6M－WKY 組（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

表2 GRK2在心肌組織中的表達(dá)

表2 GRK2在心肌組織中的表達(dá)

與6M－WKY 組比較，1）P＜0.05；與6M－SHR 組比較，2）P＜0.05；與8M－SHR 組比較，3）P＜0.05。

組別 n 總蛋白GRK2 漿蛋白GRK2 膜蛋白GRK2 6M－WKY 組 12 62.2±2.2 46.1±1.4 25.2±3.4 6M－SHR 組 12 60.7±1.9 46.8±1.7 43.9±2.61）8M－SHR 組 12 78.5±2.11）2） 58.1±0.81）2） 53.1±2.61）2）8M－SHR－D組 12 62.9±2.21）2）3）34.9±2.51）2）3） 41.8±2.41）2）3）

2.3 GRK2在心肌組織漿蛋白中的表達(dá) 與6M－WKY 組相比，6M－SHR 組心肌組織漿蛋白中GRK2的表達(dá)無(wú)明顯變化。8M－SHR組心肌組織漿蛋白中GRK2 的表達(dá)顯著增加，高于6M－SHR組（P＜0.015）和6M－WKY 組。8M－SHR－D組心肌組織漿蛋白中GRK2 的表達(dá)顯著減少，低于8M－SHR 組、6MSHR 組（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

2.4 GRK2在心肌組織膜蛋白中的表達(dá) 與6M－WKY 相比，6M－SHR組心肌組織中GRK2 的表達(dá)顯著增加（P ＜0.05）。8M－SHR組心肌組織中GRK 2的表達(dá)進(jìn)一步增加，高于6M－SHR 組 和6M－WKY 組（P ＜0.05）。8M－SHR－D 組 心肌組織中GRK 2的表達(dá)顯著減少，均低于8M－SHR組和6M－SHR組（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

2.5 GRK2在心肌組織核蛋白中的表達(dá) Western－Blot檢測(cè)結(jié)果顯示在分子量80kDa處未見(jiàn)表達(dá)條帶，提示左室心肌組織核蛋白勻漿中無(wú)GRK2的表達(dá)。

2.6 SHR 大鼠左心室組織中GRK2表達(dá)的部位及亞細(xì)胞定位的變化 熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)各組大鼠心肌細(xì)胞核內(nèi)均基本無(wú)GRK2綠色熒光。隨著月齡增加，心肌細(xì)胞膜（閏盤(pán)）GRK2 熒光逐漸增強(qiáng)，其中8M 的SHR 中心肌細(xì)胞膜（閏盤(pán)）上熒光最強(qiáng)，比索洛爾干預(yù)后8M 的SHR－D熒光強(qiáng)度變?nèi)酢＿M(jìn)一步證實(shí)GRK2在SHR 左心室心肌細(xì)胞膜（閏盤(pán)）的聚積。

2.7 各組大鼠左心室重量與左心室組織蛋白中GRK2的相關(guān)性 左心室重量和左心室心肌組織總蛋白勻漿GRK2水平（r＝0.31；P＝0.15）、漿蛋白勻漿GRK2 水平（r＝0.42；P ＝0.082）無(wú)明顯線性相關(guān)，但與膜蛋白勻漿中GRK2 水平（r＝0.91；P＜0.001）之間呈正相關(guān)。

3 討 論

高血壓病心肌肥大是心肌細(xì)胞對(duì)多種病理刺激的一種適應(yīng)性反應(yīng)，涉及細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的復(fù)雜病理生理過(guò)程［1］。GRK2與心肌肥大的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有密切聯(lián)系。

本研究發(fā)現(xiàn)6月齡、8月齡SHR 左心室已出現(xiàn)GRK2在細(xì)胞膜（閏盤(pán)）聚積的表現(xiàn)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的一致［2－5］，隨著月齡的增加，GRK2表達(dá)增加，且心肌組織總蛋白、漿蛋白和膜蛋白中GRK2，僅膜蛋白GRK2與左室組織呈正相關(guān)性。閏盤(pán)是調(diào)節(jié)肥大心肌纖維結(jié)構(gòu)的重要信息交匯中心，細(xì)胞膜骨架結(jié)構(gòu)上也存在多種細(xì)胞信號(hào)分子以及骨架蛋白，在GRK2和骨架蛋白相互作用的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)事件中發(fā)揮重要的作用。研究表明P38是種有絲分裂蛋白激活酶（MAPK），參與細(xì)胞纖維重塑，GRK2調(diào)控P38活化水平，進(jìn)而影響P38介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)［6］。這表明GRK2表達(dá)的增強(qiáng)以及細(xì)胞膜上GRK2的聚積與心肌細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)因子相互作用參與心肌肥大的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此推測(cè)干預(yù)細(xì)胞中GRK2可能達(dá)到抑制心肌肥大的作用。

Philip等［7］報(bào)道敲除GRK2基因的大鼠不僅阻止在缺血后的心肌異常重塑，而且保存了對(duì)β受體的反應(yīng)性，增強(qiáng)心肌收縮力。Scot等［8］也發(fā)現(xiàn)GRK2表達(dá)缺失的大鼠心肌對(duì)β受體激動(dòng)劑的敏感性增強(qiáng)。Hideo等［9］對(duì)表達(dá)GRK2 阻滯劑（βARKct）轉(zhuǎn)基因鼠先予主動(dòng)脈狹窄術(shù)處理后造成后負(fù)荷壓力增高，結(jié)果發(fā)現(xiàn)βARKct表達(dá)越強(qiáng)，心臟結(jié)構(gòu)重塑及功能惡化程度越弱，并且保持了腺苷酸環(huán)化酶（AC）的活力和心肌細(xì)胞膜上β受體的密度。這些研究表明心肌細(xì)胞重塑與GRK2 下調(diào)心肌細(xì)胞膜上β受體的密度有關(guān)。

比索洛爾是一種選擇性的β1 受體阻滯劑，能上調(diào)β受體，在高血壓、心肌肥大、慢性心力衰竭等方面有重要的價(jià)值，但其改善心肌重塑的機(jī)制目前尚不明了。β 受體阻滯劑能改變GRK2的表達(dá)和活性，在慢性主動(dòng)脈瓣反流的大鼠［4］等研究中均發(fā)現(xiàn)β受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑受損，GRK2水平升高，β受體阻滯劑能上調(diào)β受體的密度和數(shù)量，降低GRK2水平；在人心衰研究發(fā)現(xiàn)β受體阻滯劑能影響右心耳中GRK2的水平［3］。但這些研究缺乏對(duì)心肌細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上GRK2 的分析。比索洛爾可以抑制左室重塑，并且心肌組織中GRK2的表達(dá)減少，GRK2在細(xì)胞膜上易位減輕。原因可能為GRK2是一種細(xì)胞溶質(zhì)的酶，由胞漿易位到細(xì)胞膜實(shí)現(xiàn)GPCRs受體信號(hào)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵步驟，當(dāng)受激動(dòng)劑刺激后，實(shí)現(xiàn)GRK2的細(xì)胞膜易位［10］。因此抑制心肌細(xì)胞GRK2的表達(dá)，尤其是抑制GRK2 易位于細(xì)胞膜上，可能是比索洛爾阻止心肌細(xì)胞的肥大機(jī)制之一。

GRK2參與心肌細(xì)胞肥大的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，比索洛爾可能通過(guò)干預(yù)GRK2信號(hào)途徑從而抑制心肌肥大。這從細(xì)胞和分子水平上為逆轉(zhuǎn)左心室肥大提供了新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為臨床防治高血壓左心室肥厚提供了新的防治思路。

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