原發(fā)性高血壓頸動(dòng)脈硬化與基質(zhì)金屬蛋白酶－3基因型的相關(guān)性分析

徐春華

原發(fā)性高血壓病人導(dǎo)致血壓上升的病因不明，該病是多種心腦血管疾病的誘因與危險(xiǎn)因素［1］，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPS）能夠?qū)⒒啄ひ约鞍饣|(zhì)的絕大部分蛋白質(zhì)降解，而基質(zhì)金屬蛋白酶－3（MMP－3）被認(rèn)為是與動(dòng)脈硬化密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶，MMP－3基因的啟動(dòng)子－1171（6A／5A）的序列差異暗示高血壓病人動(dòng)脈硬化具有遺傳易感性［2］。本文分析高血壓病病人頸動(dòng)脈硬化與MMP－3基因啟動(dòng)子多態(tài)性的相關(guān)性，為有效防治高血壓病動(dòng)脈粥樣硬化提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本院2010年5月—2013年5月收治原發(fā)性高血壓病人108例（觀察組），男性62例，女性46例，年齡54歲～76歲（55.77歲±10.02歲）。全部病人根據(jù)2004年《中國高血壓病診斷指南》進(jìn)行診斷與分級(jí)，同時(shí)將肥胖者、關(guān)節(jié)疾病、痛風(fēng)、免疫疾病、慢性炎癥、近期心肌梗死、未控制的充血性心力衰竭、外周動(dòng)脈疾病、中風(fēng)伴肢體偏癱、短暫性腦缺血發(fā)作、繼發(fā)性高血壓病以及腫瘤者予以排除。在我院同期進(jìn)行健康體檢的106例體檢者作為對照組，男性63例，女性43例，年齡54歲～77歲（56.02歲±8.98歲）。兩組均對臨床生化指標(biāo)以及血液MMP－3基因型進(jìn)行檢測，觀察組高血壓者69例與對照組體檢者31例采取頸動(dòng)脈超聲檢查。

1.2 檢測方法

1.2.1 超聲檢查 應(yīng)用西門子SONOLINE G60S彩色多普勒超聲診斷儀進(jìn)行檢查，選擇探頭頻率（5.0～7.5）MHz。從頸總動(dòng)脈起始后縱向分別對頸總動(dòng)脈、分叉處、頸內(nèi)外動(dòng)脈進(jìn)行探查，至頸動(dòng)脈最高處后旋轉(zhuǎn)探頭90°角，順血管走行橫向進(jìn)行掃查，對斑塊及其位置、大小以及是否有頸動(dòng)脈內(nèi)－中膜厚度（IMT）增厚等狀況進(jìn)行觀察記錄。

1.2.2 超聲檢查指標(biāo) 頸動(dòng)脈內(nèi)－中膜厚度：在舒張末期的雙側(cè)頸總動(dòng)脈起始處、分叉前10 mm 處以及膨大處進(jìn)行分別測量；頸動(dòng)脈粥樣斑塊：局部呈凸起且增厚，向管腔內(nèi)突起的厚度＞1.2mm，對斑塊發(fā)生處進(jìn)行定位。

1.2.3 臨床檢查指標(biāo) 測定受檢者身高、體重、血壓等，計(jì)算體重指數(shù)?？崭钩槿?mL晨靜脈血，對膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL－C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL－C）以及三酰甘油（TG）檢測。

1.2.4 檢測MMP－3基因多態(tài)性 抽提受檢者血液DNA，設(shè)計(jì) 一 對 正 義 引 物 5′－GTTCTCCATTCCTTTGATGGGGGGAAAG－3′以及反義引物5′－TTCCTGGAATTCACATCACTGCCACCAC－3′進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增。對擴(kuò)增后得到的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行PsyⅠ酶切，獲得約127bp長的片段，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳后，結(jié)果顯示MMP－3 基因啟動(dòng)子－1171位點(diǎn)具有明顯的多態(tài)性，不同受檢者分別出現(xiàn)1、2、3 條泳帶，對應(yīng)三類基因型，將其命名為6A／6A、5A／5A 以及5A／6A，片段長度127bp（6A／6A）和127bp、95bp、30bp（5A／6A），95bp、30bp。通過公式：1／2（純合子×2＋雜合子）／受檢者例數(shù)來計(jì)算等位基因頻率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。受檢者基因型與Hardy－Weinberg平衡的符合度、等位基因頻率以及組間基因型對比采用四格表χ2檢驗(yàn)；對所得計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用率表示，并采取χ2檢驗(yàn)。對頸總動(dòng)脈相關(guān)參數(shù)的影響因素進(jìn)行多元逐步回歸分析，針對兩因素之間的相關(guān)性進(jìn)行Pearson 相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組基因型及等位基因頻率分布狀況 觀察組與對照組受檢者的基因型分布均與Hardy－Weinberg平衡一致。觀察組6A／6A 基因型（65.7%）與6A 等位基因頻率（82.4%）高于對照組基因型（53.8%）與等位基因頻率（75.9%），但分布差異相比不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（基因型P ＝0.092，等位基因P ＝0.118）；男女性別相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 觀察組與對照組基因型及等位基因頻率分布狀況分析

2.2 兩組基因型及頸動(dòng)脈IMT 之間的相關(guān)性 與對照組相比，觀察組5A／5A＋5A／6A 基因型病人在起始部位、膨大前以及膨大部位的IMT均出現(xiàn)增厚，兩組差異相比不顯著（P ＞0.05）；觀察組6A／6A 基因型病人在起始部位、膨大前以及膨大部位的IMT 均顯著高于對照組（P＜0.05）。詳見表2。

表2 不同基因型頸動(dòng)脈IMT 指標(biāo)對比

表2 不同基因型頸動(dòng)脈IMT 指標(biāo)對比

與對照組相比，1）P＜0.05。

基因型 起始 部 位 5A／膨5大A＋前51A0／6mAm（ m處m ） 膨大部位 起始部位 膨6A大／6前A1（0mmmm） 處 膨大部位觀察組 0.80±0.19 0.84±0.18 1.16±0.21 1.07±0.181） 0.99±0.191） 1.29±0.181）對照組 0.71±0.18 0.64±0.18 0.95±0.20 0.77±0.16 0.70±0.20 0.99±0.18

觀察組不同基因型頸總動(dòng)脈內(nèi)徑與IMT 對比分析，觀察組6A／6A 基因型病人頸總動(dòng)脈分叉前部位的IMT 高于5A／5A＋5A／6A 基因型病人（P＜0.05）；但兩基因型在頸總動(dòng)脈內(nèi)徑方面相比不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表3。

表3 觀察組不同基因型頸總動(dòng)脈內(nèi)徑與IMT 對比

表3 觀察組不同基因型頸總動(dòng)脈內(nèi)徑與IMT 對比

同5A／5A＋5A／6A 基因型相比，1）P＜0.05。

基因型 分叉前處IMT（mm） 頸總動(dòng)脈內(nèi)徑（mm）5A／5A＋5A／6A（16） 0.84±0.18 7.05±0.81 6A／6A（54） 0.99±0.191） 7.21±0.79

2.3 心血管病危險(xiǎn)因素

2.3.1 心血管病一般危險(xiǎn)因素與IMT 的相關(guān)性 簡單相關(guān)性：病人年齡、脈壓、舒張壓、收縮壓以及體重指數(shù)與IMT 的Pearson 相關(guān)系數(shù)（r）依次為0.661，0.392，0.039，0.409，－0.334（P＜0.05）；偏相關(guān)：在限制年齡后，病人的脈壓、舒張壓、收縮壓以及體重指數(shù)與IMT 的Pearson 相關(guān)系數(shù)（r）依次為0.114，0.188，0.225，－0.304（P＜0.05）。

2.3.2 觀察組頸總動(dòng)脈IMT 與內(nèi)徑影響因素的逐步回歸結(jié)果將觀察組頸總動(dòng)脈IMT 與內(nèi)徑（D）均作為應(yīng)變量（Y），將危險(xiǎn)因素 年齡（Xa）、脈壓（Xb）、收縮壓（Xc）、舒張壓（Xd）、體重指數(shù)（Xe）、基因型（Xf）、三酰甘油（Xg）以及低密度脂蛋白膽固醇（Xh）作為自變量進(jìn)行逐步回歸分析。結(jié)果表明：病人年齡與舒張壓是頸總動(dòng)脈內(nèi)徑的關(guān)鍵影響因素（回歸系數(shù)依次為0.05，0.027，P＜0.05，YD＝1.594＋0.05Xa＋0.027Xc）；病人年齡、舒張壓、體重指數(shù)是IMT 的關(guān)鍵影響因素（回歸系數(shù)依次為0.010，0.008，－0.005，P＜0.05，YIMT＝－0.221＋0.010Xa＋0.008Xc－0.005Xe）。

3 討 論

同時(shí)對健康人群與心血管病高危人群開展的心血管病研究以及流行病學(xué)研究均提示，頸動(dòng)脈內(nèi)－中膜厚度指標(biāo)與大部分傳統(tǒng)的心血管病的危險(xiǎn)因素之間具有一定的相關(guān)性，而且對健康人群開展的研究顯示，年齡與內(nèi)－中膜厚度之間呈現(xiàn)出線性相關(guān)，高齡人群發(fā)生普遍的IMT 增厚者并未全部檢出斑塊形成，故而提出IMT 增厚在某種意義上來說是機(jī)體老化過程中所伴發(fā)的生理反應(yīng)［3］。高血壓病患者所處的分級(jí)越高、脈壓越大，其頸動(dòng)脈內(nèi)徑就越大，IMT 厚度增加以及斑塊的檢出率就越高［4］。使用脈壓來預(yù)測心血管事件的危險(xiǎn)程度較應(yīng)用收縮壓與舒張壓更加靈敏，脈壓是心腦血管疾病發(fā)病與致死的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，脈壓升高與心血管病病人的死亡率密切相關(guān)［5］。本研究簡單相關(guān)分析結(jié)果表明，受檢者的年齡與IMT 之間具有最密切的相關(guān)性，病人年齡、脈壓、收縮壓以及體重指數(shù)與頸總動(dòng)脈內(nèi)－中膜厚度均有密切的相關(guān)性，但在限制年齡后的偏相關(guān)分析顯示，病人的脈壓、收縮壓以及體重指數(shù)與內(nèi)－中膜厚度的相關(guān)性均出現(xiàn)降低，差異比較不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

基質(zhì)金屬蛋白酶屬于內(nèi)切蛋白水解酶家族成員之一，其發(fā)揮作用需有鋅離子存在，該酶能夠降解基底膜及胞外基質(zhì)部位的絕大部分蛋白質(zhì)［6］。MMP－3作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一，其具有廣泛的特異性底物，包括膠原、蛋白聚糖、層連蛋白、纖連蛋白以及明膠等，除可以將上述底物降解以外，處于活性狀態(tài)的MMP－3還能夠?qū)⑵渌冈せ睿M(jìn)一步產(chǎn)生一個(gè)正反饋環(huán)，故而MMP－3 在MMPS 家族激活途徑中具有重要作用；MMP－3在斑塊降解、纖維沉積及鈣化過程中發(fā)揮作用，其啟動(dòng)子具有多態(tài)性，包括高活性5A／5A、中間活性5A／6A 以及低轉(zhuǎn)錄活性6A／6A。6A／6A 基因型者與頸動(dòng)脈IMT 較厚具有密切的相關(guān)性，6A／6A 基因型的男性IMT 較其他基因型者厚15%左右，而且6A／6A 基因型的健康男性其IMT 也較其他健康基因型要厚［7］。

孫曉明等［8］對頸內(nèi)動(dòng)脈狹窄病人的研究表明，對照組6A純合子的基因型頻率與6A 等位基因頻率顯著低于觀察組，這與本研究結(jié)果相符。本研究中6A／6A 基因型者頸動(dòng)脈IMT 出現(xiàn)增厚，且內(nèi)徑增大；6A／6A 基因型者較6A／5A 基因型者斑塊多。6A／6A 基因型者在其動(dòng)脈壁中存在少量的有活性的基質(zhì)細(xì)胞溶解酶，推測這是由其低水平的基因轉(zhuǎn)錄而引發(fā)的微弱蛋白水解活動(dòng)，這將加快細(xì)胞外基質(zhì)的沉積速度，最終使動(dòng)脈硬化斑塊進(jìn)一步產(chǎn)生并發(fā)展。MMP－3能夠參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展過程，MMP－3低表達(dá)基因型個(gè)體的重塑以及降解基質(zhì)的能力低下，造成動(dòng)脈壁內(nèi)中膜快速增厚并形成斑塊。6A 等位基因是造成頸內(nèi)動(dòng)脈狹窄的一個(gè)獨(dú)立性危險(xiǎn)因子。本結(jié)果顯示，病人年齡、體重指數(shù)以及舒張壓是頸動(dòng)脈內(nèi)－中膜厚度的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素，而基因型則沒有進(jìn)入逐步回歸方程，推測這可能是由于本樣本偏少造成的。此外，在對136例糖尿病病人以及101例健康男性受檢者的研究中，健康男性的6A／6A 基因型者其頸動(dòng)脈內(nèi)徑寬，且其IMT 出現(xiàn)增厚，而糖尿病組病人的三個(gè)基因型之間相比不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［9］。

由于檢測技術(shù)、儀器設(shè)備等諸多因素影響，本項(xiàng)研究尚存在一定的不足，目前認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是由多基因控制的疾病，基因多態(tài)性與基因表達(dá)之間具有密切的相關(guān)性，單個(gè)基因的效應(yīng)常常被遮蓋住，難以顯現(xiàn)出來，故而應(yīng)依據(jù)其病理生理的變化情況，研究多個(gè)候選基因，從整體上、多角度進(jìn)行分析，而且選取的樣本量應(yīng)大，注意要有充分的代表性，明確各個(gè)基因多態(tài)性的效應(yīng)，進(jìn)而實(shí)施有針對性的方法來調(diào)控MMPS的表達(dá)情況，最終實(shí)現(xiàn)治療的目的。

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