慢性乙型肝炎患者肝組織基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-1表達(dá)及其意義*

朱傳龍，李毓雯，李文庭，李宜，高人燾

·慢性乙型和丙型肝炎·

慢性乙型肝炎患者肝組織基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-1表達(dá)及其意義*

朱傳龍，李毓雯，李文庭，李宜，高人燾

目的分析慢性乙型肝炎患者血清和肝組織基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-1（TIMP-1）表達(dá)水平與肝纖維化分期的相關(guān)性。方法分別采用免疫組化法和雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)患者肝組織和血清TIMP-1表達(dá)水平，分析兩者相關(guān)性；對(duì)159例慢性乙型肝炎患者行肝活檢病理學(xué)檢查，以組織學(xué)活動(dòng)指數(shù)（HAI）予以分級(jí)（G）和分期（S），分析慢性乙型肝炎患者血清TIMP-1水平與HAI分級(jí)和纖維化分期的相關(guān)性。結(jié)果慢性乙型肝炎患者肝組織TIMP-1表達(dá)水平與其血清水平呈顯著性正相關(guān)（r=0.9521，P＜0.01）；不同肝纖維化分期（S1～S4）慢性乙型肝炎患者血清TIMP-1水平差異顯著（P＜0.05），且血清TIMP-1水平與肝纖維化分期呈正相關(guān)（r=0.704，P＜0.01），但不同炎癥分級(jí)的慢性乙型肝炎患者血清TIMP-1水平差異無(wú)顯著性。結(jié)論血清TIMP-1水平可以較好地反應(yīng)肝臟纖維化程度，且不受肝組織炎癥分級(jí)的影響，有望被用于肝組織纖維化程度的臨床無(wú)創(chuàng)評(píng)估。

慢性乙型肝炎；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-1；肝纖維化；炎癥

乙型肝炎肝硬化患者肝組織病理學(xué)變化的基礎(chǔ)是肝纖維化。肝組織活檢是目前診斷肝纖維化的金指標(biāo)，但因其具有創(chuàng)傷性，容易發(fā)生出血和疼痛等并發(fā)癥而限制了其臨床應(yīng)用。臨床常用的血清學(xué)指標(biāo)如透明質(zhì)酸（HA）、層粘蛋白（LN）、Ⅳ型膠原（CⅣ）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）等因與肝組織的炎癥壞死程度關(guān)系密切，其血清水平往往受到肝臟炎癥的影響，給臨床上正確評(píng)估肝纖維化的程度帶來(lái)一定的困難。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)丙型肝炎患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-1（TIMP-1）水平與肝組織纖維化程度呈正相關(guān)[1，2]。然而，在慢性乙型肝炎患者，兩者的相關(guān)性問(wèn)題尚不

明確。本研究檢測(cè)了慢性乙型肝炎患者血清TIMP-1水平和肝組織TIMP-1表達(dá)水平，以探討血清TIMP-1水平診斷肝纖維化分期的可能性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象2007年12月～2009年10月在解放軍第123醫(yī)院和我院確診的慢性乙型肝炎患者159例，男性113例，女性46例；年齡為18～62歲，平均年齡（42.0±6.5）歲。按照慢性乙型肝炎防治指南（2010版）的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]診斷，排除慢性腎、肺和心臟疾病。另選同期健康獻(xiàn)血員10例，男性7例，女性3例；平均年齡（32.0±8.4）歲。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，本研究在安徽省立醫(yī)院倫理委員會(huì)備案。

1.2 血清TIMP-1水平檢測(cè)采用雙抗體夾心ELISA法，抗TIMP-1單克隆抗體（McAb）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。操作步驟如下：以0.05 M碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）為包被液，將稀釋成一定濃度的抗TIMP-1單克隆抗體分別滴加在96孔聚苯乙烯板微孔內(nèi)，每孔100 μl，4 ℃過(guò)夜，次日甩盡包被液，用0.05%（v/v）Tween-20 PBS（PBST）洗板3次，每次3 min，拍干后加封閉液（含15%小牛血清的PBS）200 μl/孔，37℃1 h，4 ℃過(guò)夜，次日棄之，PBST洗滌3次，每次3 min；將標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)血清（待測(cè)樣品用PBS作1∶100稀釋）加于包被孔內(nèi)，并設(shè)陰性對(duì)照、空白對(duì)照，37℃水浴1 h，PBST洗板5次，拍干后加HRP2抗TIMP-1 100μl/孔，37℃30 min，PBST洗板5次，徹底拍干后加入TMB顯色劑，50 μl/孔，37℃15 min，加2M H2SO450μl/孔，終止反應(yīng)；在酶標(biāo)儀（Elx800型，BIO-TEKINSTRUMENTS.INC）450 nm處測(cè)量吸光度A值（OD值，以空白對(duì)照孔調(diào)零），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測(cè)血清TIMP-1水平。

1.3 肝組織病理學(xué)檢查采用負(fù)壓針吸肝活檢，肝組織長(zhǎng)度為＞1.5 cm，用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，行連續(xù)切片，常規(guī)HE、網(wǎng)狀纖維和Masson染色。由解放軍第123醫(yī)院病理科做出組織學(xué)診斷，其中G2S0～4患者48例，G0～4S2患者41例。

1.4 肝組織TIMP-1檢測(cè)采用SP法（免疫組化試劑盒SP-9001購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），石蠟切片4 μm，常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波加熱暴露抗原，滴加兔源TIMP-1多克隆抗體（購(gòu)自武漢博士德公司），1∶100稀釋，4 ℃冰箱過(guò)夜，PBS洗片后滴加羊抗兔二抗（1∶500），37℃孵育1 h，DAB顯色，控制在3～5 min，復(fù)染、脫水、透明、封片。顯色強(qiáng)度經(jīng)HPIAS-1000病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)（武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司）進(jìn)行定量分析。每張切片隨機(jī)取10個(gè)視野，計(jì)算肝組織TIMP-1表達(dá)的陽(yáng)性密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，測(cè)定值用（±s）表示，采用t檢驗(yàn)及直線相關(guān)分析，組間均數(shù)的比較采用方差分析，P＜0.05表示有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 血清TIMP-1水平與肝組織TIMP-1表達(dá)水平的相關(guān)性在16例慢性乙型肝炎患者，同時(shí)檢測(cè)肝組織TIMP-1表達(dá)和檢測(cè)血清TIMP-1水平，結(jié)果顯示肝組織TIMP-1表達(dá)與血清水平之間呈顯著性正相關(guān)。直線回歸方程為：Y=1.078X+16.55（r=0.9521，P＜0.01，圖1）。

圖1 慢性乙型肝炎患者肝組織TIMP-1表達(dá)與血清TIMP-1水平的相關(guān)性

2.2 血清TIMP-1水平與肝組織纖維化分期之間的關(guān)系選擇本組G2S08例、G2S110例、G2S215例、G2S39例和G2S46例。檢測(cè)他們血清TIMP-1水平發(fā)現(xiàn)，隨著肝纖維化程度的加重，血清TIMP-1水平逐步升高，其中G2S1與G2S2組、G2S2與G2S3組和G2S3與G2S4組之間相比，差異顯著（P＜0.01）。血清TIMP-1水平與肝組織纖維化分期之間呈顯著性正相關(guān)（r=0.704，P＜0.01，圖2）。

圖2 不同肝組織纖維化分期慢性乙型肝炎患者血清TIMP-1水平比較

2.3 血清TIMP-1水平與炎癥活動(dòng)度分級(jí)之間的關(guān)系從159例慢性乙型肝炎患者中篩選出G0～4S2患者41例，其中G1S2組12例、G2S2組15例和G3S2組14例。取患者外周血清，采用ELISA法檢測(cè)TIMP-1水平。結(jié)果顯示：G1S2與G2S2組、G1S2與G3S2組、G2S2與G3S2組之間相比，血清TIMP-1水平均無(wú)顯著性差異（P＞0.05，圖3）。

圖3 不同炎癥活動(dòng)度分級(jí)慢性乙型肝炎患者血清TIMP-1水平比較

3 討論

自1995年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病學(xué)與寄生蟲病學(xué)學(xué)會(huì)、2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病學(xué)與寄生蟲病學(xué)會(huì)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)合制定的《病毒性肝炎防治方案》把血清HA、PCⅢ、CⅣ和LN水平作為診斷肝纖維化的指標(biāo)以來(lái)，由于病例選擇、檢測(cè)方法、檢測(cè)試劑等方面的差異，在應(yīng)用血清標(biāo)志物診斷肝組織炎癥壞死活動(dòng)度和肝纖維化的程度方面結(jié)果常不一致。因?yàn)檠錒A、PCⅢ、CⅣ和LN不僅與纖維化程度有關(guān)，而且與肝組織的炎癥壞死程度也可能關(guān)系密切，給臨床上正確評(píng)估肝纖維化的程度帶來(lái)一定的困難，其對(duì)肝纖維化的診斷僅起到臨床參考作用。在2003年，Rosenberg et al指出急需建立一種可靠的、重復(fù)性高的非創(chuàng)傷性監(jiān)測(cè)肝纖維化的指標(biāo)，最好是一種血清學(xué)標(biāo)志物,說(shuō)明了血清學(xué)診斷肝纖維化的重要性[4，5]。

有關(guān)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的研究發(fā)展迅速，在正常肝臟的纖維組織中存在著ECM生成與降解的動(dòng)態(tài)平衡，肝纖維化是ECM生成與降解過(guò)程失衡的結(jié)果。既往對(duì)ECM的生成與沉積研究較多，近年開始對(duì)ECM降解的研究亦日益深入。在ECM降解過(guò)程中，基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制物的平衡起著至關(guān)重要的作用?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一組能降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的重要蛋白分解酶，MMPs是一組鋅酶，幾乎能降解除多糖以外的所有ECM成分，并能使MMPs家族其它成員相繼激活，形成瀑布效應(yīng)。人體已發(fā)現(xiàn)的MMP有20種，按照作用底物不同，MMP可分為4類，即間質(zhì)膠原酶、基質(zhì)溶解素、明膠酶和膜型金屬蛋白酶[6～8]。TIMPs是一組具有抑制MMPs功能的活性多肽，他們?cè)贓CM代謝的調(diào)節(jié)中起著非常重要的作用。TIMPs在肝臟中來(lái)源主要為HSC、Kupffer細(xì)胞，以及少量來(lái)源于肝細(xì)胞。TIMPs是組織中MMPs主要的內(nèi)源性抑制因子，受許多參與MMP基因調(diào)控的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的同步調(diào)控，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)四種TIMP，即TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4，它們對(duì)目前已知的MMPs均具有抑制作用[9～11]。大量研究已經(jīng)證實(shí)，TIMP-1、TIMP-2在肝組織的過(guò)度表達(dá)與肝纖維化的形成密切相關(guān)[1，12～14]。除此之外，TIMPs家族在心、肺、腎等多種臟器的纖維化病程中也發(fā)揮至關(guān)重要的作用。Heymans S et al通過(guò)對(duì)36例主動(dòng)脈狹窄患者心肌標(biāo)本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞TIMP-1、TIMP-2的高表達(dá)與心肌組織纖維化和功能障礙的發(fā)生密切相關(guān)，說(shuō)明TIMPs也是導(dǎo)致心室擴(kuò)大和心肌重構(gòu)的主要因素之一。因此，該基因在今后可能作為主動(dòng)脈狹窄患者潛在的治療靶點(diǎn)[15]。同樣，MMPs和TIMPs的比例失調(diào)在肺纖維化膠原代謝紊亂中起重要作用，肺組織TIMP-1和TIMP-2活性的升高可以抑制MMP-9和MMP-2活性，影響肺組織正常的修復(fù)和膠原降解，從而發(fā)生肺組織纖維化[16～18]。另外，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的4種TIMPs均能在腎組織表達(dá)。大量研究表明，TIMPs在慢性腎臟病發(fā)生發(fā)展中起著不可替代的作用，其中TIMP-1的過(guò)度表達(dá)是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的主要原因之一[19，20]。

綜上所述，TIMPs在心、肝、肺和腎臟纖維化發(fā)生機(jī)制中起重要作用，血清TIMPs（主要為TIMP-1、2）水平升高，能使MMPs活性下降，引起組織ECM積聚，促使發(fā)生纖維化。因此，目前認(rèn)為血清TIMP-1和TIMP-2水平可以反映多種臟器纖維化的程度。然而，通過(guò)檢測(cè)血清TIMPs水平評(píng)估慢性肝病患者纖維化程度可能受到其他臟器組織異常分泌TIMPs水平的影響，從而影響TIMPs作為診斷肝纖維化血清指標(biāo)的特異性。因此，現(xiàn)有的大部分臨床研究資料均顯示，TIMPs作為肝纖維化診斷血清學(xué)指標(biāo)，其檢測(cè)的特異性相對(duì)較差[21]。

本研究中，為評(píng)估TIMP-1與慢性乙型肝炎肝纖維化的關(guān)系，所選研究對(duì)象均排除了合并有慢性心臟、腎臟和肺疾病，以及其他原因所致的慢性肝病。我們對(duì)慢性乙型肝炎患者肝組織進(jìn)行免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，隨著肝纖維化程度的加重，TIMP-1在肝臟的表達(dá)量逐步升高，主要表現(xiàn)在肝組織間質(zhì)細(xì)胞和部分肝細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)的增多。對(duì)肝組織TIMP-1表達(dá)水平進(jìn)一步行半定量分析并與血清水平相比較，發(fā)現(xiàn)組織TIMP-1與血清水平之間具有顯著性正相關(guān)，說(shuō)明在慢性乙型肝炎患者，血清TIMP-1水平可以很好地反映肝臟TIMP-1表達(dá)水平。因此，在今后的臨床工作中，如果能排除慢性乙型肝炎患者合并有其他臟器的纖維化疾患，血清TIMP-1水平的檢測(cè)可以代替患者肝組織TIMP-1表達(dá)的檢測(cè)，從而避免不必要的肝活檢。

在本研究中，我們對(duì)159例慢性乙型肝炎患者進(jìn)行肝活檢，并予以肝組織病理學(xué)檢查。結(jié)果肝組織炎癥分級(jí)為G2的慢性乙型肝炎患者48例，其中G0期8例、G1期10例、G2期15例、G3期9例和G4期6例；肝組織纖維化分期為S2的慢性乙型肝炎患者41例，其中S1級(jí)12例、S2級(jí)15例和S3級(jí)14例。對(duì)肝組織炎癥G2級(jí)患者進(jìn)行血清TIMP-1檢測(cè)，結(jié)果顯示隨著肝纖維化程度的加重，慢性乙型肝炎患者血清TIMP-1水平逐步升高，G2S1、G2S2、G2S3和G2S4四組之間TIMP-1水平相比差異顯著（P＜0.05），且血清TIMP-1水平與肝組織纖維化分期之間呈顯著性正相關(guān)。對(duì)41例肝組織纖維化S2期患者進(jìn)行血清TIMP-1水平檢測(cè)，結(jié)果顯示G1S2、G2S2和G3S2組之間TIMP-1水平相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。以上研究結(jié)果提示，血清TIMP-1水平與肝組織纖維化分期具有很好的相關(guān)性，可以反映肝組織的纖維化程度，且不受肝組織炎癥程度的影響。故在臨床上可綜合考慮及動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，以更好更準(zhǔn)確地判斷慢性乙型肝炎患者肝纖維化病程的進(jìn)展趨勢(shì)。

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（收稿：2013-11-29）

（校對(duì)：陳從新）

Clinical significance of tissue inhibitor of metalloproteinases-1 in livers of patients with chronic hepatitis B

Zhu Chuanlong，Li Yuwen，Li Wenting，et al.Department of Infectious Disease，Anhui Provincial Hospital，Anhui Medical University，Hefei 230001，Anhui Province，China

Objective To evaluate the expression of tissue inhibitor of metalloproteinases-1（TIMP-1）in livers of patients with chronic hepatitis B（CHB）and to explore the potential relationship between TIMP-1 level and hepatic fibrosis progression.Methods The tissue and serum levels of TIMP-1 were determined by immunohistochemistry and double-antibody sandwich enzyme-linked immunoadsorbent assay，respectively，and their correlation was determined.One hundred and fifty-nine patients with CHB underwent liver biopsy and their liver histological activity index（HAI）and fibrosis（S）were determined.The correlation between the serum TIMP-1 levels and HAI grading and staging was analyzed.Results The expression of TIMP-1 in liver tissues were positively correlated to serum TIMP-1 levels in CHB patients（r=0.9521，P<0.01）；Serum TIMP-1 levels were significant different among patients with different liver fibrosis stages（S1to S4）（P<0.05），and a positive correlation between serum TIMP-1 level and hepatic fibrosis staging was found（r=0.704，P<0.01）；However，there were no significant differences in serum TIMP-1 levels among patients with different liver inflammatory grades.Conclusions Serum TIMP-1 level is not affected by liver inflammatory grades and is promising in non-invasive clinical evaluation of liver fibrosis.

Chronic hepatitis B；Tissue inhibitor of metalloproteinases-1；Hepatic fibrosis；Inflammation

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.03.007

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81271713）；安徽省第五批優(yōu)秀青年科技基金滾動(dòng)支持項(xiàng)目（1308085JGD09）；安徽醫(yī)科大學(xué)校長(zhǎng)基金資助項(xiàng)目（2011xkj074）

230001 合肥市安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院感染病科（朱傳龍，李文庭，李宜，高人燾）；兒內(nèi)科（李毓雯）

朱傳龍，男，33歲，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師。主要從事病毒性肝炎的基礎(chǔ)與臨床研究

高人燾，E-mail：rentaogao@sohu.com