DNA甲基化和去甲基化的研究現(xiàn)狀及思考

鄧大君

北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院／研究所, 北京 100142

DNA甲基化和去甲基化的研究現(xiàn)狀及思考

鄧大君

北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院／研究所, 北京 100142

DNA甲基化通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、印記、X染色體滅活和防御外源性遺傳物質(zhì)入侵等, 在細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)和疾病發(fā)生發(fā)展上發(fā)揮重要作用, 是當(dāng)前表觀遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。文章介紹了在過去幾年中TET介導(dǎo)的DNA羥甲基化及其在早期胚胎發(fā)育中的作用, DNA主動去甲基化及其與被動去甲基化的關(guān)系, DNA甲基化建立及其與組蛋白修飾、染色質(zhì)構(gòu)象、多梳蛋白和非編碼RNA結(jié)合等關(guān)系方面的重要研究進(jìn)展和存在的問題以及DNA甲基化的轉(zhuǎn)化應(yīng)用前景。

DNA甲基化; 去甲基化; 表觀遺傳學(xué); 穩(wěn)態(tài); 轉(zhuǎn)化研究

DNA甲基化是指DNA序列中的腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)堿基在甲基化轉(zhuǎn)移酶的催化下與甲基發(fā)生共價結(jié)合, 可在細(xì)胞分裂過程中傳遞給子細(xì)胞的表觀遺傳現(xiàn)象。由DNA腺嘌呤甲基化酶(DNA adenine methylase, DAM)催化形成的 O6-甲基腺嘌呤(6mA)是一種CTA G序列復(fù)制后維持甲基化, 在細(xì)菌表觀遺傳過程中發(fā)揮作用, 具體功能包括染色體復(fù)制、錯配修復(fù)、毒力基因表達(dá)控制、外源性基因防御等[1,2]。近年發(fā)現(xiàn) DNA腺嘌呤甲基化還參與細(xì)菌細(xì)胞周期控制[3]。細(xì)菌DNA腺嘌呤甲基化的具體過程及功能已經(jīng)研究的比較清楚, 本文不做進(jìn)一步敘述。存在于高等生物細(xì)胞內(nèi)的 C5-甲基胞嘧啶(5mC)由一組DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase, DNMT)催化形成, 包括從頭甲基化和DNA復(fù)制后維持甲基化兩種形成途徑。在成年脊椎動物體細(xì)胞中主要發(fā)生在胞嘧啶-鳥嘌呤(G)二核苷酸(CpG)位點(diǎn)上; 在植物細(xì)胞和動物胚胎干細(xì)胞還可發(fā)生在非CpG位點(diǎn)上。胞嘧啶甲基化在多細(xì)胞生物的細(xì)胞分化和環(huán)境適應(yīng)方面發(fā)揮重要作用, 具體功能包括X染色體滅活、基因印記、基因長效沉默、細(xì)胞分化、外源基因防御、異物代謝等, 是比較活躍的研究領(lǐng)域之一, 近年取得了諸多研究進(jìn)展。本文簡要綜述了DNA去甲基化的機(jī)制和 DNA甲基化建立及維持研究的主要進(jìn)展, 并對存在的幾個關(guān)鍵問題進(jìn)行了討論。

1 DNA主動去甲基化及其機(jī)制

DNA胞嘧啶甲基化是一種共價修飾, 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。5mC有兩種形成途徑：DNA半保留復(fù)制后由UHRF1(Ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1)招募DNMT1, 催化半甲基化DNA雙鏈中未甲基化鏈的維持甲基化(Maintenance methylation); 由DNMT3a和DNMT3b催化未甲基化DNA雙鏈的從頭甲基化(de novo methylation)。DNA去甲基化也存在被動去甲基化和主動去甲基化兩種途徑。細(xì)胞可通過抑制DNMT1表達(dá)或催化活性來阻斷 DNA的維持甲基化, 在細(xì)胞分裂過程中稀釋/降低基因組中甲基化胞嘧啶的密度, 實(shí)現(xiàn)被動去甲基化(圖 1A)。最近日本學(xué)者報道, 這種被動去甲基化機(jī)制是小鼠胚胎發(fā)育過程中原生殖細(xì)胞(Primordial germ cell)去除基因組親本DNA甲基化的關(guān)鍵機(jī)制[4]。在高等脊椎動物卵子受精后, 經(jīng)過 4次卵裂, 除印記基因外, 基因組DNA將完全去甲基化, 形成全能的胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell, ESC)。在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cell, iPSC)形成過程中也存在類似的完全去甲基化現(xiàn)象。卵裂過程中如果只存在被動去甲基化, 經(jīng)過4次分裂的ESC基因組中至少還應(yīng)該保留1/16的甲基化胞嘧啶, 無法實(shí)現(xiàn)完全去甲基化。顯然, 在胚胎干細(xì)胞中還存在其他去甲基化的機(jī)制。

胞嘧啶脫氨基酶能夠催化未甲基化和甲基化胞嘧啶脫氨基, 分別形成尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T)。甲基化胞嘧啶的脫氨基效率明顯高于未甲基化者。胞嘧啶脫氨基是脊椎動物進(jìn)化過程中基因組發(fā)生 CpG抑制(CpG suppression)的主要原因。在腫瘤細(xì)胞基因組中, 大部分點(diǎn)突變都是CpG位點(diǎn)的胞嘧啶轉(zhuǎn)換成胸腺嘧啶(C:G→T:A)[5,6]。由于脫氨基形成的尿嘧啶或胸腺嘧啶與互補(bǔ)鏈上的鳥嘌呤不配對, 在正常情況下大部分將在尿嘧啶或者胸腺嘧啶 DNA糖苷酶等的催化下, 按堿基切除修復(fù)(BER)方式修復(fù)。通過這種胞嘧啶脫氨基-堿基切除修復(fù)途徑, 細(xì)胞的確有實(shí)現(xiàn)DNA主動去甲基化的可能。在受到感染、輻射等致癌物打擊后, 宿主靶器官/組織的胞嘧啶脫氨基酶(包括APOBEC和AID等)含量會迅速上升, 全基因組同步低甲基化。尚不清楚這種脫氨基酶活性的升高是否為全基因組低甲基化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Popp等[7]研究表明, AID缺乏小鼠的原生殖細(xì)胞全基因組甲基化水平升高, 但是胚胎和胎盤組織的總甲基化水平無差別, 提示AID可能僅在原生殖細(xì)胞主動去甲基化過程中發(fā)揮作用。AID是胞嘧啶脫氨基酶家族的一員, 在離體條件下能夠使單鏈DNA胞嘧啶脫氨基, 在 B細(xì)胞中高表達(dá), 促進(jìn)編碼免疫球蛋白IgM的基因轉(zhuǎn)化成編碼IgG的基因。該基因遺傳缺陷將導(dǎo)致常染色體隱性遺傳病——免疫缺陷綜合征(無IgG、IgA、IgE, 對細(xì)菌感染高度易感)或Ⅱ型高IgM綜合征 (HIGM2)。在脊椎動物細(xì)胞基因組中還存在許多其他DNA胞嘧啶脫氨基酶。不同的胞嘧啶脫氨基酶有不同的DNA序列偏好, 如AID偏好WRC Y(W=A或T; R=嘌呤; Y=嘧啶), APOBEC偏好胞嘧啶串(Cs)上的末位胞嘧啶, APOBEC1偏好 TC位點(diǎn), APOBEC3DC偏好WC 位點(diǎn), 卻未發(fā)現(xiàn)偏好CpG位點(diǎn)的胞嘧啶脫氨基酶。盡管甲基化胞嘧啶的脫氨基效率明顯高于未甲基化者, 胞嘧啶脫氨基-堿基切除修復(fù)途徑是否為脊椎動物細(xì)胞實(shí)現(xiàn)CpG位點(diǎn)主動去甲基化的主要途徑尚缺乏定論。

2009年美國的兩個研究小組同時發(fā)現(xiàn)腦組織和ESC DNA中存在5-羥甲基胞嘧啶(hmC), 證明TET1 (Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1)能夠催化DNA中5mC氧化成為hmC(圖2), 推測hmC的功能之一是參與DNA主動去甲基化[8,9]。2011年徐國良等與美國學(xué)者同步報道, TET1和TET2基因還能夠使 hmC進(jìn)一步氧化, 形成 5-醛基胞嘧啶(fC)和5-羧基胞嘧啶(caC)[10,11]; 在離體條件下DNA中的caC可被胸腺嘧啶DNA糖苷酶切除, 用siRNA敲減該酶含量后ESC中caC含量升高, 推測它參與了caC的堿基切除修復(fù)過程(圖1B)。TET3基因在小鼠受精卵去除雄原核 DNA甲基化標(biāo)記過程中也能發(fā)揮作用[12]。Williams等[13]也報道, 在哺乳動物ESC基因組中廣泛存在TET1蛋白結(jié)合和hmC。值得注意的是, Hackett等[14]報道TET1和TET2蛋白催化的hmC形成與小鼠原始生殖細(xì)胞分裂過程平行, 在去除親本 DNA甲基化印記過程中發(fā)揮作用, 提示TETs介導(dǎo)的DNA主動去甲基化與細(xì)胞分裂過程存在密切關(guān)系。TET1和TET2可與干細(xì)胞因子NANOG相互結(jié)合, 共同在誘導(dǎo)小鼠細(xì)胞獲得多能性過程中發(fā)揮作用[15]。

盡管斑馬魚等低等脊椎動物的精子 DNA的甲基化水平與其體細(xì)胞相同, 在胚胎發(fā)育早期, 雄源性 DNA的總甲基化水平仍然維持不變[16～18], 這與小鼠等哺乳動物胚胎發(fā)育早期基因組存在普遍的去甲基化明顯不同。相反, 斑馬魚在卵子成熟過程中就完成了全基因組去甲基化, 而小鼠卵子在受精卵分裂(卵裂)過程中才能夠完成全基因組去甲基化, 盡管這種去甲基化在卵子成熟過程中就開始了[19]。這些結(jié)果說明, 在低等脊椎動物與哺乳動物之間, 與 ESC獲得全能性相關(guān)的基因組去甲基化方式存在明顯差別。

那么, DNA主動去甲基化與被動去甲基化之間是否存在內(nèi)在聯(lián)系呢？在常規(guī)的堿基切除修復(fù)過程中需要切除一小段核苷酸序列(2～6 bp), 而 CpG位點(diǎn)的甲基化在DNA雙鏈中是對稱性的。如果DNA雙鏈上同一甲基化CpG位點(diǎn)發(fā)生同步氧化和堿基切除修復(fù), 將導(dǎo)致 DNA雙鏈斷裂, CpG位點(diǎn)密集(如CpG島和Alu元件及重復(fù)序列LINE)的DNA甚至可能碎片化(圖 1B)。如果以細(xì)胞分裂過程中形成的半甲基化DNA為切除修復(fù)底物, 則可避免這種DNA斷裂或碎片化。如上所述, 被動去甲基化和TET氧化5mC均在原生殖細(xì)胞DNA去甲基化過程中發(fā)揮作用[14]。筆者認(rèn)為全基因組TET主動去甲基化存在與DNA被動去甲基化配合完成的可能(圖1C)。

圖1 5-甲基胞嘧啶的被動(A)、主動(B)、被動伴主動(C)去甲基化模式

圖2 DND胞嘧啶的修飾與去修飾過程

在缺乏細(xì)胞分裂相關(guān)的被動去甲基化的條件下, DNA是否能夠?qū)崿F(xiàn)主動去甲基化呢？2012年沈哲鯤等[20]報道, 在非細(xì)胞體系中, DNMT3a和DNMT3b能夠直接切除雙鏈 DNA胞嘧啶中的羥甲基, 而DNMT1無此作用。DNMTs基因在ESC中基本不表達(dá), 在分化的細(xì)胞(如胚球和衍生的體細(xì)胞)中表達(dá),在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。DNMTs是否的確參與這些分化細(xì)胞的主動去甲基化過程還有待研究。在植物細(xì)胞去甲基化方面, 2012年Qian等[21]發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞內(nèi)的乙?；窱DM1可以與甲基化的DNA結(jié)合, 催化該區(qū)域的組蛋白發(fā)生乙?；? 創(chuàng)造環(huán)境使5mC糖苷酶發(fā)揮功能, 從而使DNA發(fā)生去甲基化。

hmC不僅參與原生殖細(xì)胞和ESC去甲基化, 而且還可不進(jìn)一步氧化, 穩(wěn)定地存在于成體組織細(xì)胞中。在不同成年組織的細(xì)胞中, hmC的分布與核小體組蛋白H3K27me3存在高度的相關(guān)性[22]。hmC在成年組織的細(xì)胞基因組內(nèi)為什么不會象在ESC中那樣進(jìn)一步氧化？其功能尚未明確。在小鼠腦組織中, hmC可以較高的豐度穩(wěn)定存在[8]; 在斑馬魚和人體細(xì)胞老化過程中, 其體細(xì)胞基因組中臨近CpG島周圍區(qū)域(CpG island shores)的甲基化水平不斷降低[23];在胰腺腫瘤基因組中hmC的含量不斷降低, 可聚集在原癌基因DNA上[24]。

最近研究表明, hmC的形成還受環(huán)境因素影響,二甲基亞砜(DMSO)處理會顯著促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞 hmC含量[25]; 還原型維生素C處理可明顯提高小鼠ESC TET1的催化活性和 hmC水平[26]; 苯巴比妥處理能夠迅速誘發(fā)大鼠肝臟基因組hmC的分布改變[27]。這些結(jié)果提示hmC的穩(wěn)定性比5mC低, 對環(huán)境因素更加易感, 與環(huán)境適應(yīng)基因的甲基化狀態(tài)改變關(guān)系更密切。

2 DNA甲基化狀態(tài)的建立和維持

基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(TSS)周圍 CpG島甲基化是基因長期穩(wěn)定沉默的標(biāo)志, 在細(xì)胞分化過程中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。哺乳動物的胚泡(Blastocyst)內(nèi)完全去甲基化的ESC按照不同的分化方向, 在DNMT3a和3b的催化下發(fā)生有序的從頭甲基化, 建立細(xì)胞分化相關(guān)甲基化譜。從頭甲基化和去甲基化現(xiàn)象還廣泛存在于機(jī)體正常適應(yīng)環(huán)境和疾病的發(fā)生發(fā)展過程中,建立環(huán)境適應(yīng)相關(guān)甲基化譜。在DNMTs高表達(dá)的細(xì)胞中(例如腫瘤細(xì)胞), DNA中的CpG位點(diǎn)的默認(rèn)狀態(tài)到底是非甲基化的還是甲基化的？腫瘤抑制基因的甲基化失活是腫瘤組織中的常見現(xiàn)象, 一般認(rèn)為這種失活的機(jī)制是這些基因的轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物招募了DNMTs, 導(dǎo)致CpG島甲基化。然而, 這一理論不能解釋為什么在體細(xì)胞基因的軀干部位(Gene body)70%以上的散在CpG位點(diǎn)都是甲基化的。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種轉(zhuǎn)錄基因維持去甲基化狀態(tài)的機(jī)制。長鏈非編碼RNA(lncRNA)不僅可通過競爭性結(jié)合miRNA或PcG蛋白等途徑來發(fā)揮正向調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用[28～35], 而且還可通過與 DNMT1結(jié)合來阻斷其甲基化活性, 維持目的基因DNA的去甲基化狀態(tài)[36]。H3K4me3是基因存在轉(zhuǎn)錄活性的標(biāo)志, H3K4me1則是H3K4me3形成的基礎(chǔ)。2009年Hu等[37]發(fā)現(xiàn)未甲基化的H3K4是DNMT3L的結(jié)合區(qū), 能夠促進(jìn)DNMT3L-DNMT3a復(fù)合物的從頭甲基化作用。未甲基化的H3K4還能夠誘導(dǎo)DNMT3a蛋白的構(gòu)象變化, 提高其甲基化酶活性; DNMT3a的甲基化活性與H3K4me1的含量存在負(fù)相關(guān)關(guān)系[38]。近年來, 包括ENCODE研究在內(nèi)的各種高分辨率的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合組和DNA甲基化組研究揭示, 活性基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近序列是轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的穩(wěn)定結(jié)合區(qū),在這些區(qū)域染色質(zhì)中普遍存在甲基化的H3K4, DNA則呈低甲基化狀態(tài)[39]?；蚪M中 DNA的甲基化與核小體的分布亦存在高度的相關(guān)性。在人胃癌發(fā)生過程中, p16基因CpG島甲基化具有以核小體為基本單元脈沖式擴(kuò)展的特征[40]。在降低組蛋白甲基化酶 G9A和 SUV39H1蛋白水平和基因啟動子區(qū)H3K9me2/3水平后, 啟動子區(qū)結(jié)合的 HP1和DNMT1減少[41]。Ficz等[42]用hmC特異性抗體對全基因組進(jìn)行hMeDIP-測序分析, 發(fā)現(xiàn)hmC大部分分布于小鼠胚胎干細(xì)胞常染色質(zhì)區(qū)。Sun等[43]用AbaSI酶切-測序法發(fā)現(xiàn), hmC主要分布在小鼠ESC基因組的CTCF結(jié)合區(qū), 特別是存在H3K4me1的區(qū)域, 而不是在H3K27ac富集區(qū)。在骨髓間質(zhì)干細(xì)胞中也存在高水平的hmC[44]。種種跡象表明, 在DNMT1充分表達(dá)的條件下, DNA中大部分CpG位點(diǎn)的默認(rèn)狀態(tài)是甲基化的。在基因常轉(zhuǎn)錄的區(qū)域存在活躍的DNA去甲基化現(xiàn)象。上述現(xiàn)象說明, 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及其相關(guān)的組蛋白修飾在維持 DNA去甲基化狀態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。一旦基因處于非轉(zhuǎn)錄狀態(tài),則將失去這些去甲基化機(jī)制的保護(hù), 發(fā)生甲基化。

我們最近的工作表明, 盡管腫瘤細(xì)胞中 p16基因的甲基化和非甲基化狀態(tài)非常穩(wěn)定, 仍然伴有低水平的局部甲基化和羥甲基化及去甲基化, 這種局部甲基化變化不穩(wěn)定地存在于每個細(xì)胞中, 說明該基因的甲基化狀態(tài)是以穩(wěn)態(tài)(Homeostasis)的模式維持(待發(fā)表)。因此, 有必要對甲基化狀態(tài)穩(wěn)態(tài)維持是否具有普遍性、穩(wěn)態(tài)調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成等開展進(jìn)一步研究, 以了解表觀遺傳的本質(zhì)。

3 結(jié)語與展望

人體內(nèi)存在 200多種不同類型的細(xì)胞, 不僅各自有不同的細(xì)胞分化相關(guān)DNA甲基化譜, 而且還有隨著生存環(huán)境因素和年齡的變化而變化的適應(yīng)相關(guān)DNA 甲基化譜。顯然, 與基因組相比較, 人體內(nèi)DNA甲基化組等表觀遺傳組更加復(fù)雜多樣, 研究工作尤其艱巨。DNA基因組序列完全相同的人 ESC如何分化成不同的細(xì)胞？DNA甲基化如何與其他表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)協(xié)調(diào)工作？這些網(wǎng)絡(luò)是怎樣有效適應(yīng)不同生存環(huán)境因素變化的？這些網(wǎng)絡(luò)在疾病發(fā)生過程中究竟發(fā)揮了什么作用？哪些能夠用于疾病的預(yù)防、診斷和治療？這些都是仍然有待闡明的熱點(diǎn)問題。表觀遺傳現(xiàn)象極其復(fù)雜, 一方面需要杰出的科學(xué)家們繼續(xù)創(chuàng)造性地工作, 以揭示DNA甲基化等表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)啟動、擴(kuò)展、維持、去除的基本規(guī)律, 另一方面還需要投入相當(dāng)?shù)馁Y源, 發(fā)展靈敏可靠的低成本單細(xì)胞組學(xué)分析技術(shù), 剖析DNA甲基化等在影響疾病發(fā)生、評價環(huán)境因素安全、增加農(nóng)作物產(chǎn)量和抗病能力中的作用及機(jī)制, 研究其潛在應(yīng)用價值。隨著深度測序成本的降低和各種數(shù)據(jù)挖掘軟件的出現(xiàn), 動物體內(nèi)不同類型細(xì)胞之間和不同物種之間的比較表觀遺傳組學(xué)的研究可望蓬勃發(fā)展, DNA甲基化的進(jìn)化形成機(jī)制有望得到揭示。

與直接檢測基因的表達(dá)產(chǎn)物 RNA和蛋白質(zhì)不同, 基因轉(zhuǎn)錄啟始點(diǎn)周圍CpG島甲基化狀態(tài)反映的是基因表達(dá)狀態(tài)的長期穩(wěn)定變化, 在各種條件下保存的樣品中均能夠穩(wěn)定存在。此外, 甲基化和非甲基化的CpG島可分別使用甲基化和非甲基化特異性技術(shù)檢測, 檢測方法極其靈敏。這些使得CpG島甲基化變異具備成為理想的生物學(xué)標(biāo)志物的各項(xiàng)條件,尤其是在檢測雜合性組織中存在的少數(shù)細(xì)胞時能夠發(fā)揮特殊作用[46]。目前歐洲已經(jīng)批準(zhǔn)用循環(huán)性SEPT9甲基化篩查結(jié)腸癌, 本課題組用 p16甲基化早期預(yù)測上皮異型增生癌變診斷試劑也在開發(fā)中;用循環(huán)型 MGMT甲基化預(yù)測甲基脲類化療藥物敏感性開始用于臨床試驗(yàn); DNA甲基化阻斷劑脫氧雜氮胞苷已經(jīng)批準(zhǔn)用于骨髓異型增生綜合征的臨床治療, 開始向其他瘤種擴(kuò)展[45]。我國是疾病資源和人力資源大國, 當(dāng)前掀起的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究高潮使得DNA甲基化與疾病關(guān)系研究也在全國各地不斷展開,近期有望涌現(xiàn)一批有臨床用途的DNA甲基化產(chǎn)品。

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(責(zé)任編委: 朱衛(wèi)國)

DNA methylation and demethylation: current status and future perspective

Dajun Deng

Peking University Cancer Hospital and Institute, Beijing 100142, China

DNA methylation plays important roles in cell differentiation, embryonic development, host adaptations to environmental factors, and pathogenesis through regulation of gene transcription and imprinting, X-inactivation, and defense of foreign genetic material invasion, is currently one of the hottest research fields on epigenetics. In the past few years, a number of important findings on DNA methylation have been achieved. These findings include discovery of TETs-catalyzed cytosine hydroxymethylation and its functions in the early embryonic development; the relationship between active and passive DNA demethylation; establishment and maintenance of DNA methylation patterns and their associations with histone modifications, chromatin configuration, polycomb group proteins and non-coding RNA bindings. DNA methylation has become a new potential biomarker and therapy target.

DNA methylation; demethylation; epigenetics; homeostasis; translational research

2014-01-07;

2014-01-27

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：30921140311，31261140372)資助

鄧大君，教授，研究方向：腫瘤病因?qū)W和DNA甲基化研究。E-mail：dengdajun@bjmu.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0403

時間: 2014-3-3 12:41:25

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140303.1241.001.html