陸地棉皺縮葉突變體基因wr3的初步定位

李峰利，狄佳春，趙亮，陳旭升

1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南京 210095；

2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江下游棉花與油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014

陸地棉皺縮葉突變體基因wr3的初步定位

李峰利1，狄佳春2，趙亮2，陳旭升2

1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南京 210095；

2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江下游棉花與油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014

陸地棉皺縮葉突變體是本項(xiàng)目組自主發(fā)現(xiàn)的一種自然突變體。前期對(duì)其表型性狀的觀察發(fā)現(xiàn)該突變體的農(nóng)藝性狀有別于前人已報(bào)道的皺葉突變體；通過(guò)陸陸雜交世代群體對(duì)其遺傳規(guī)律的研究表明，皺縮葉突變性狀是受一對(duì)完全隱性基因wr3控制的質(zhì)量性狀。文章以皺葉突變自交系L037和海7124為親本配置組合得到的海陸雜交F2為作圖群體，利用本實(shí)驗(yàn)室遴選的平均覆蓋棉花26對(duì)染色體上的234對(duì)SSR引物(每染色體相對(duì)等距離分布9對(duì)引物)，通過(guò)對(duì)雙親以及近等基因池的篩選，共得到12對(duì)多態(tài)性引物。用這些引物檢測(cè)F2作圖群體每個(gè)單株的標(biāo)記基因型，經(jīng)Join Map 4.0分析顯示，位于Chr.21的引物BNL3279與目的基因連鎖，二者間的遺傳距離為28.7 cM。隨后對(duì)Chr.21上的其他引物進(jìn)一步篩選，共得到16對(duì)與目的基因連鎖的標(biāo)記，其中與目的基因距離最近的標(biāo)記NAU3740的遺傳距離為4.8 cM，另一側(cè)標(biāo)記cgr5428的遺傳距離為10.4 cM。由此推定，皺縮葉突變體基因wr3在棉花第21染色體上。

陸地棉；皺縮葉突變體；基因定位；SSR；BSA分析法

皺葉突變體性狀表現(xiàn)明顯，表型穩(wěn)定，受環(huán)境的影響較少，易于識(shí)別、分組和計(jì)數(shù)，在突變體庫(kù)的構(gòu)建和經(jīng)典遺傳學(xué)基因定位中具有重要作用。國(guó)外在 20世紀(jì)已有關(guān)于棉花皺葉突變體的報(bào)道。Harland[1,2]和Hutchinson等[3]分別在海島棉和陸地棉中發(fā)現(xiàn)了“矮皺突變體”，突變體的皺葉性狀與植株的矮化特征伴隨發(fā)生，遺傳分析表明，兩個(gè)矮皺突變體均是受1對(duì)隱性基因控制的質(zhì)量性狀。Turcotte等[4]報(bào)道在Pima棉F3株系后代中發(fā)現(xiàn)1個(gè)受1對(duì)顯性基因 Ru控制的皺葉突變體。Kohel[5]在陸地棉中發(fā)現(xiàn)另一種皺葉突變，遺傳分析顯示，該突變體受1對(duì)顯性基因Crp控制。Dilday等[6]運(yùn)用等位性與連鎖測(cè)試分析了陸地棉一系列的葉型突變體，發(fā)現(xiàn)在第15染色體上的單基因位點(diǎn)皺葉(cr)和另2個(gè)復(fù)等位基因位點(diǎn)即帶狀葉(s)和葉脈融合突變(vf)緊密連鎖。Turcotte等[7]報(bào)道在海島棉栽培種PimaS-4中發(fā)現(xiàn)了一種葉片極度皺縮突變體，該突變受 1對(duì)隱性基因 wr1控制。之后，Turcotte[8]報(bào)道在海島棉中發(fā)現(xiàn)第2個(gè)皺葉突變，該皺葉突變也受1對(duì)隱性單基因控制；研究顯示該皺葉突變基因與早前報(bào)道的突變基因 wr1不等位，顯示其為一個(gè)新突變，基因符號(hào)定為wr2。Kohel報(bào)道在陸地棉變種Rex中發(fā)現(xiàn)一種新的皺葉突變，該突變體活力很低，呈半矮生狀態(tài)，表型性狀在開(kāi)花前呈現(xiàn)，且隨著植株生育期的推進(jìn)，葉片皺縮程度不斷加強(qiáng)。遺傳研究顯示，該突變性狀受1對(duì)單隱性基因rx控制[9]。

國(guó)內(nèi)簡(jiǎn)桂良等[10]報(bào)道，1985年新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)一農(nóng)科所技術(shù)員發(fā)現(xiàn) 1株皺葉海島棉，該海島棉子葉較小，葉片變厚，第1、2片真葉不皺縮或輕微皺縮，葉片缺刻淺，第 3片真葉以后的葉片、葉肉全部皺縮。戴日春[11]在陸地棉新黃綠苗突變體浙12-12N的遺傳鑒定中提到，用黃綠苗突變體與浙農(nóng)皺縮葉突變體等材料雜交，但沒(méi)有更多關(guān)于浙農(nóng)皺縮葉突變體的后續(xù)深入研究報(bào)道。陳旭升等[12]報(bào)道在陸地棉中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的皺葉突變體，該突變體成熟植株的株高比正常葉植株還要略高，皺葉性狀約從第8片果枝葉開(kāi)始表達(dá)，而后從下到上逐漸明顯，直至生育期結(jié)束，這與Turcotte在海島棉中報(bào)道的2個(gè)皺葉突變?cè)诒磉_(dá)時(shí)序上存在明顯的差異。采用陸陸雜交群體遺傳研究顯示，該突變體是受一對(duì)隱性基因控制的質(zhì)量性狀；為區(qū)別 Turcotte報(bào)道的皺縮葉，擬將其基因符號(hào)定為wr3。

迄今關(guān)于棉花皺縮葉突變體的公開(kāi)研究報(bào)道多局限于經(jīng)典遺傳學(xué)方法進(jìn)行遺傳分析與連鎖測(cè)驗(yàn)，僅明確這些突變性狀的受控基因是單基因還是雙基因、顯性還是隱性基因。關(guān)于皺葉性狀的基因定位報(bào)道較少。本研究擬采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)陸地棉 wr3基因進(jìn)行染色體初步定位，旨在為進(jìn)一步的精細(xì)定位和克隆奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

以正常葉海島棉品種“海7124”為母本，陸地棉皺縮葉突變體自交系“L037”為父本進(jìn)行雜交獲得F1。然后以F1自交獲得的F2分離群體為作圖群體，用于皺縮葉基因wr3的初步定位。

1.2 方法

1.2.1 PCR 擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

所有親本和群體單株的DNA提取參考Paterson等[13]方法。利用本實(shí)驗(yàn)室遴選的多態(tài)性較好且平均覆蓋棉花26對(duì)染色體上的234對(duì)SSR引物(每染色體相對(duì)等距離分布9對(duì)引物)，參照張?zhí)煺娴萚14]的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)在PTC-200(MJ research)上進(jìn)行。擴(kuò)增結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)恒壓 200 V 非變性PAGE凝膠電泳，凝膠濃度8%～10%，電泳緩沖液為1×TBE，電泳結(jié)束后，參照張軍等方法進(jìn)行染色[15,16]。1.2.2 目的基因的染色體定位

在F2群體中隨機(jī)選取皺縮葉植株和正常葉植株各10株，用scandrop250超微量核算蛋白測(cè)定儀測(cè)定各DNA的濃度，統(tǒng)一稀釋成40 ng/μL后，吸取等量的DNA分別混合，作為近等基因池。利用234對(duì)引物對(duì)作圖親本和F2近等基因池進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，篩選出具有多態(tài)性的引物。然后，用多態(tài)性引物檢測(cè) F2群體150個(gè)單株的標(biāo)記基因型，連鎖分析得到與目的基因連鎖的引物，從而鎖定目標(biāo)染色體。合成目標(biāo)染色體上的SSR引物進(jìn)行加密，以實(shí)現(xiàn)目的基因的初步定位。

統(tǒng)計(jì)多態(tài)性條帶，與皺葉L037帶型相同的個(gè)體記為“1”，與海7124帶型相同的個(gè)體記為“2”，共顯性雜合帶型記為“3”，缺失記為“0”。然后，進(jìn)行 χ2適合性測(cè)驗(yàn)，驗(yàn)證標(biāo)記分離比例是否符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。利用 JoinMap 4.0[17]進(jìn)行連鎖分析，LOD值為3，用Kosambi 作圖函數(shù)計(jì)算標(biāo)記間的遺傳距離(cM)。

2 結(jié)果與分析

2.1 皺縮葉突變體的表型特征及其F2群體分離規(guī)律

皺縮葉性狀在苗期不表現(xiàn)，該突變性狀出現(xiàn)的時(shí)間約在第 8果枝葉后，在初花期表達(dá)明顯，而后出現(xiàn)的其他果枝節(jié)位均表現(xiàn)為皺葉，而且由下到上葉片皺葉性狀表達(dá)逐漸明顯。皺葉會(huì)導(dǎo)致部分葉片局部失綠，有些葉表面表現(xiàn)類似燙傷的皺縮狀，表面有泡狀突起，部分葉片加厚呈革質(zhì)狀(圖1)。

圖1 皺縮葉突變體不同果枝葉的表型特征葉片編號(hào)由 1到 10，代表同一棉株由下到上不同果枝葉的表型特征。1、2為第8果枝葉之前的正常葉片，3～10為第8果枝葉以后的皺縮葉片。

在皺縮葉性狀明顯表達(dá)的初花期，對(duì)海7124與L037雜交的F2群體表型性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，F(xiàn)2群體共計(jì) 150株，其中表現(xiàn)皺縮葉性狀的隱性個(gè)體共43株，正常葉個(gè)體共107株?？ǚ竭m合性測(cè)驗(yàn)結(jié)果顯示，雜交 F2的分離擬合正常葉:皺縮葉=3:1的分離比例(χ2=0.334＜χ20.05,1=3.84)，符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。以上結(jié)果表明，皺縮葉突變體是受1對(duì)完全隱性基因控制的質(zhì)量性狀。與本項(xiàng)目組前期在陸地棉中的研究結(jié)果一致[12]。

2.2 SSR標(biāo)記的多態(tài)性篩選和目的基因wr3的染色體定位

利用234對(duì)引物對(duì)親本皺葉L037和海7124進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，最終獲得了 169對(duì)多態(tài)性引物，多態(tài)率為72.22 %。依據(jù)BSA法，采用上述引物對(duì)F2近等基因池進(jìn)行二次篩選，共得到12對(duì)多態(tài)性引物，多態(tài)率為3.13%。

以這12對(duì)多態(tài)性引物檢測(cè) F2作圖群體每個(gè)單株的標(biāo)記基因型，對(duì)電泳條帶的數(shù)據(jù)做連鎖分析，結(jié)果顯示共顯性標(biāo)記BNL3279與目的基因連鎖，兩者間的遺傳距離為28.7 cM。對(duì)照Z(yǔ)hao等[18]發(fā)表的高密度棉花遺傳圖譜，標(biāo)記BNL3279位于Chr.21(D11)上。隨后合成了該染色體目標(biāo)區(qū)段的SSR引物，通過(guò)對(duì)親本的篩選得到24對(duì)多態(tài)性引物。以這些引物檢測(cè)F2作圖群體每個(gè)單株的基因型并做連鎖遺傳分析，結(jié)果顯示，共有16對(duì)SSR標(biāo)記與目標(biāo)基因wr3發(fā)生連鎖，它們分別為標(biāo)記 BNL2895、NAU4026、NAU4855、NAU0984、Gh132、NAU6315、BNL3279、CIR077、 NAU6697、 NAU6593、 NAU6658、NAU3740、cgr5428、BNL2650、NAU2016和NAU429(圖2)。其中，標(biāo)記NAU3740與目的基因的遺傳距離4.8 cM，另一側(cè)標(biāo)記cgr5428與目的基因的遺傳距離為10.4 cM，由此推斷，皺縮葉突變體基因wr3在棉花Chr.21(D11)上。

3 討 論

由于突變體在作物遺傳、品種改良、基因定位、基因分離與鑒定以及基因表達(dá)與調(diào)控等研究中均具有重要的意義，因此構(gòu)建和篩選突變體庫(kù)顯得尤為重要，并成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。擬南芥大規(guī)模突變體庫(kù)中已包含22 5000個(gè)T-DNA插入突變體[19]，水稻中也有超過(guò)20 0000個(gè)插入標(biāo)簽側(cè)翼序列[20]。相對(duì)于擬南芥和水稻，棉花突變體庫(kù)的構(gòu)建仍處于初級(jí)階段。

自然突變具有不定向、突變譜廣等特點(diǎn)，是獲得突變材料的重要途徑，可以為突變體庫(kù)的構(gòu)建提供重要原始材料。目前已正式鑒定的異源四倍體棉花質(zhì)量性狀基因約計(jì)200個(gè)(包括重疊基因)，其中包括紅株、亞紅株、植株矮化等各種突變型[21～23]。異源四倍體棉種的質(zhì)量基因連鎖群見(jiàn)諸報(bào)道的有 18個(gè)，其中12個(gè)已經(jīng)與特定的染色體相聯(lián)系，分別是第 1、3、4、5、6、7、12、15、16、18、20和 26染色體[24]。

圖2 皺縮葉突變體基因wr3的連鎖圖譜A：為Zhao等已發(fā)表的海陸種間Chr.21遺傳圖；B：為皺縮葉突變體基因wr3的定位連鎖圖。

本研究以陸地棉中自主發(fā)現(xiàn)的皺縮葉突變體為實(shí)驗(yàn)材料，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，成功地將 wr3基因定位在NAU3740和cgr5428之間，從分子遺傳學(xué)水平將目標(biāo)基因定位在棉花Chr.21(D11)上。該研究成果有兩方面科學(xué)意義：(1) 目標(biāo)性狀的成功定位可以為棉花第 21染色體質(zhì)量性狀基因連鎖群的構(gòu)建提供一個(gè)新路標(biāo)。該皺縮葉突變體作為一個(gè)新的形態(tài)學(xué)標(biāo)記可用于棉花突變體庫(kù)的構(gòu)建，突變體本身也可以作為對(duì)性測(cè)驗(yàn)和連鎖測(cè)驗(yàn)的遺傳材料被利用；(2) 目的基因的成功定位可為未來(lái)對(duì)該基因的精細(xì)定位與克隆提供參考依據(jù)，也可為控制皺縮葉性狀的關(guān)鍵基因的挖掘、分離和功能分析及其生理生化機(jī)理的研究提供科學(xué)指導(dǎo)。

[1] Harland SC. On the genetics of crinkled dwarf rogues inSea Island cotton. West Ind Bull, 1918, 16(1): 82.

[2] Harland SC. The genetics of cotton. Part IX. Further experience on the inheritance of the crinkled dwarf mutant of G. barbadense L. in interspecific cross and their bearing on Fisher theory of dominance. J Genet, 1933, 28(2): 315-325.

[3] Hutchinson JB, Ghose RU. On the occurrence of crinkled dwarf in Gossypium hirsutum L. J Genet, 1937, 34(3): 437-446.

[4] Turcotte EL, Carl V, Feaster. Inheritance of rugate leaf in pima cotton. J Hered, 1965, 56(5): 234-236.

[5] Kohel RJ. Genetic analysis of the crumpled mutant in Gossypium hirsutum L. Crop Sci, 1973, 13(3): 384-386.

[6] Dilday RH, Kohel RJ, Richmond TR. Genetic analysis of leaf differentiation mutants in upland cotton. Crop Sci, 1975, 15(3): 393-397.

[7] Turcotte EL, Feaster CV. Inheritance of a leaf mutant in American Pima cotton. J Hered, 1980, 71(2): 134-135.

[8] Turcotte EL. Inheritance of a second wrinkled leaf mutant in American Pima cotton. Crop Sci, 1987, 27(4): 702-704.

[9] Kohel RJ. Genetic analysis of the Rex mutant in cotton. J Hered, 1989, 80(1): 78-80.

[10] 簡(jiǎn)桂良, 馬存, 鄭傳臨. 新疆發(fā)現(xiàn)皺葉海島棉. 中國(guó)棉花, 1994, 21(2): 20.

[11] 戴日春. 陸地棉新黃綠苗突變體浙 12-12N的遺傳鑒定.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 1995, 7(2): 105-110.

[12] 陳旭升, 狄佳春, 馬曉杰. 陸地棉皺縮葉突變性狀質(zhì)量遺傳規(guī)律分析. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 24(4): 7-9.

[13] Paterson AH, Brubaker C, Wendel JF. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Mol Bio Rep, 1993, 11(2): 122-127.

[14] 張?zhí)煺? 袁有祿, 郭旺珍, Yu J, Kohel RJ. 棉花高強(qiáng)纖維QTLs的微衛(wèi)星標(biāo)記篩選.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2001, 34(4): 363-366.

[15] 張軍, 郭旺珍, 張?zhí)煺? 棉花微衛(wèi)星標(biāo)記的 PAGE/銀染快速檢測(cè). 棉花學(xué)報(bào), 2000, 12(5): 267-269.

[16] Zhang J, Guo WZ, Zhang TZ. Molecular linkage map of allotetraploid cotton (Gossypium hirsutum L. × Gossypium barbadense L.) with a haploid population. Theor Appl Genet, 2002, 105: 1166-1174.

[17] Van Ooijen, 2006. Joinmap 4, Software for the calculation of genetic linkage maps in experimental populations. Kyazma BV, Wageningen, Netherands. http://www.kyazma.nl/index. php/mc.JoinMap/.

[18] Zhao Liang, Lv Yuanda, Cai Caiping, Tong Xiangchao, Chen Xiangdong, Zhang Wei, Du Hao, Guo Xiuhua, Guo Wangzhen. Toward allotetraploid cotton genome assembly: integration of a high-density molecular genetic linkage map with DNA sequence information. BMC Genomics, 2012, 13: 539-570.

[19] Alonso JM, Stepanova AN, Leisse TJ, Kim CJ, Chen HM, Shinn P, Stevenson DK, Zimmerman J, Barajas P, Cheuk R. Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science, 2003, 301(5633): 653-657.

[20] 楊松濤, 張濤, 鄭家奎. 水稻突變體庫(kù)研究進(jìn)展. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2010, 26(19): 27-30.

[21] 趙亮, 蔡彩平, 張?zhí)煺? 郭旺珍. 陸地棉紅株基因(R1)的精細(xì)定位. 科學(xué)通報(bào), 2009, 54(7): 888-891.

[22] 宋振云, 楊志敏, 陳旭升. 陸地棉亞紅株突變體基因的初步定位. 作物學(xué)報(bào), 2007, 33(3): 511-513.

[23] 景超, 馬曉杰, 狄佳春, 陳旭升. 陸地棉超矮桿突變體基因的初步定位. 遺傳, 2011, 33(12): 1393-1397.

[24] 潘家駒. 棉花育種學(xué). 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1998, 70-72.

(責(zé)任編委: 李付廣)

Mapping of a new wrinkled leaf (wr3) gene in upland cotton

Fengli Li1, Jiachun Di2, Liang Zhao2, Xusheng Chen2

1. Agronomy College of Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
2. Key Laboratory of Cotton and Rape in the Lower Reaches of the Yangtze River, Ministry of Agriculture, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China

The phenotype of a wrinkled leaf mutant in upland cotton newly found was different from other analogous mutants reported previously. Genetic analysis indicates that the mutation is controlled by a single recessive gene wr3. In this paper, an F2mapping population derived from the mutation inbred line L037 crossing with Hai7124 (Gossypium babardense) was used. A total of 12 pairs of polymorphic primers were selected from 234 pairs of SSR primers obtained before, which covered 26 pairs of cotton chromosomes at regular intervals. Genetic mapping of the F2population showed that gene wr3was linked to the primer BNL3279 on Chr.21 with the distance of 28.7 cM. Further screening of other primers on Chr.21 showed that gene wr3was flanked by the primers NAU3740 and cgr5428, with genetic distance of 4.8 cM and 10.4 cM, respectively.

Gossypium hirsutum; wrinkled leaf mutant; gene mapping; SSR; bulked segregation analysis

2014-06-04;

2014-08-26

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)子課題(編號(hào)：2011ZX08005-001)和轉(zhuǎn)基因特色專用棉新品種培育項(xiàng)目(編號(hào)：2011ZX08005-005)資助

李峰利，碩士研究生，研究方向：棉花分子遺傳育種。E-mail: 776840727@qq.com

陳旭升，研究員，研究方向：棉花遺傳育種。E-nail: njcxs@126.com

10.3724/SP.J.1005.2014.1256

時(shí)間: 2014-9-28 14:30:04

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140928.1623.005.html