番茄熱激蛋白90的全基因組鑒定及分析

劉云飛，萬紅建，楊悅儉，韋艷萍，李志邈，葉青靜，王榮青，阮美穎，姚祝平，周國治

1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，杭州 310021；

2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京 210095

番茄熱激蛋白90的全基因組鑒定及分析

劉云飛1,2，萬紅建1，楊悅儉1，韋艷萍1,2，李志邈1，葉青靜1，王榮青1，阮美穎1，姚祝平1，周國治1

1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，杭州 310021；

2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京 210095

熱激蛋白90(Heat shock protein 90，Hsp90)是植物應(yīng)對(duì)不良環(huán)境脅迫產(chǎn)生的一類特定的抗逆蛋白。文章以番茄(Solanum lycopersicum L.)基因組數(shù)據(jù)為平臺(tái)，借助生物信息學(xué)方法對(duì)Hsp90基因家族進(jìn)行鑒定與分析。結(jié)果表明，番茄至少含有7個(gè)Hsp90基因，不均勻分布在6條染色體上，氨基酸序列長度為267～794aa，內(nèi)含子數(shù)目為 2～19；共線性分析發(fā)現(xiàn)兩對(duì)基因(Hsp90-1和 Hsp90-3，Hsp90-5和 Hsp90-7)以片段重復(fù)形式存在。MEME(Multiple Em for Motif Elicitation)分析顯示，番茄Hsp90基因編碼的氨基酸序列具有多個(gè)保守基序；聚類分析揭示番茄、水稻(Oryza sativa L.)和擬南芥(Arabidopsis thaliana L.)Hsp90基因可以分為5組，存在3對(duì)直系同源基因和4對(duì)旁系同源基因；基于RNA-seq數(shù)據(jù)庫表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)基因(Hsp90-5、Hsp90-6和Hsp90-7)在營養(yǎng)器官和生殖器官中表達(dá)量較高，4個(gè)基因(Hsp90-1、Hsp90-2、Hsp90-3和Hsp90-4)除在番茄轉(zhuǎn)色后10 d的果實(shí)中表達(dá)量較高外，其余組織中表達(dá)量均較低；對(duì)Hsp90基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)參與植物對(duì)逆境脅迫的順式作用元件，如 HSE、CCAAT-box。此外，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，在葉片熱脅迫條件下，番茄Hsp90基因的表達(dá)量均存在增強(qiáng)趨勢(shì)，表明這些基因參與了番茄葉片應(yīng)對(duì)高溫脅迫的反應(yīng)。研究結(jié)果為鑒定番茄Hsp90基因的功能和進(jìn)化起源奠定了基礎(chǔ)。

番茄；熱激蛋白；基因重復(fù)；表達(dá)分析

植物生長發(fā)育過程中通常受到各種不良環(huán)境條件的影響，如非生物脅迫(高溫、干旱、鹽、冷害等)和生物脅迫(真菌、細(xì)菌、病毒及線蟲等)。近年來，隨著全球氣候變暖以及設(shè)施栽培的普遍發(fā)展，高溫脅迫已成為影響植物正常生長發(fā)育的主要因素之一[1]。植物在長期進(jìn)化過程中已形成完善的抵御不良環(huán)境條件的調(diào)控機(jī)制。目前研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫條件下植物細(xì)胞內(nèi)熱激蛋白(Heat shock protein, Hsp) 的合成顯著增加[2～4]，并且已證實(shí)該蛋白在植物抵御高溫過程中發(fā)揮著重要作用[2]。熱激蛋白廣泛存在于動(dòng)物、植物以及微生物中[5]，按分子量大小將 Hsp分為不同的家族，主要包含 Hsp60、Hsp70/Hsp80、Hsp90、Hsp110和小分子量 Hsp(smHsp)家族[6]。Hsp90基因家族結(jié)構(gòu)高度保守，為真核生物細(xì)胞質(zhì)中廣泛存在的一類分子伴侶[7,8]，參與蛋白的折疊、激活以及成熟過程，同時(shí)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)化及穩(wěn)定有關(guān)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，Hsp90基因不僅被非生物脅迫誘導(dǎo)，如鹽堿、高溫、低溫、重金屬等[10,11]，而且還可參與植物對(duì)病原菌的抵抗，Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Hsp90基因家族成員TaHsp90.2 和TaHsp90.3過表達(dá)的小麥植株對(duì)條銹病具有顯著抗性。

目前，部分植物Hsp90基因家族成員已經(jīng)鑒定完成。擬南芥(Arabidopsis thaliana L.)中已鑒定出7個(gè) Hsp90基因[13]，水稻(Oryza sative L.)中含 9個(gè)Hsp90基因[14]。番茄(Solanum lycopersicum L.)為世界上第二大蔬菜作物，同時(shí)也是我國蔬菜產(chǎn)業(yè)中的主要成員，但其生產(chǎn)常受到高溫等非生物脅迫的影響。番茄全基因組測(cè)序的完成為在全基因組水平上進(jìn)行Hsp90基因的挖掘提供了條件[15]。本文對(duì)番茄Hsp90基因家族的成員進(jìn)行了鑒定，并進(jìn)一步分析Hsp90基因的數(shù)目、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、染色體定位、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及表達(dá)模式等，以期為番茄Hsp90基因的功能鑒定以及耐熱番茄品種的培育奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

番茄Hsp90基因家族成員相關(guān)信息主要來自兩個(gè)基因組數(shù)據(jù)庫(http://solgenomics.net/和 http://mips. helmholtz-muenchen.de/plant/tomato/searchjsp/index.jsp)。根據(jù)Krishna等[13]研究結(jié)果在NCBI網(wǎng)站中獲得擬南芥Hsp90基因家族成員信息。根據(jù)Hu等[14]研究結(jié)果，從水稻基因組網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu. edu/analyses_search_locus.shtml)獲得水稻 Hsp90基因家族成員信息。

1.2 方法

1.2.1 番茄Hsp90基因家族的鑒定

本研究采用兩種方法對(duì)番茄Hsp90基因進(jìn)行檢索：(1)在上述兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中分別輸入關(guān)鍵詞“heat shock protein 90”進(jìn)行搜索，獲得番茄Hsp90基因相關(guān)信息；(2)利用擬南芥Hsp90基因氨基酸序列對(duì)番茄數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastp搜索。搜索結(jié)果中去除重復(fù)基因，即獲得候選基因，然后通過Pfam網(wǎng)站(http://pfam. janelia.org/)進(jìn)行鑒定。番茄 Hsp90基因的等電點(diǎn)以及分子量通過網(wǎng)站(http://web.expasy.org/compute _pi/)的pI/Mw計(jì)算工具獲得。

1.2.2 番茄Hsp90基因內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)分析

將每個(gè)番茄 Hsp90基因的核苷酸序列及相應(yīng)的基因組序列分別以 FASTA格式導(dǎo)入網(wǎng)站(http:// gsds.cbi.pku.edu.cn/)，利用在線工具 Gene Structure Display Server(GSDS)[16]，繪制Hsp90基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)模式圖。

1.2.3 番茄Hsp90基因染色體定位

結(jié)合番茄基因組數(shù)據(jù)庫中獲得的Hsp90基因位置信息，通過 MapDraw V2.1軟件對(duì) 7個(gè)鑒定的Hsp90基因進(jìn)行染色體定位。將番茄Hsp90基因名稱提交到網(wǎng)站http://chibba.agtec.uga.edu/duplication/ index/locus，分析這些基因的重復(fù)特征(串聯(lián)重復(fù)和片段重復(fù))。

1.2.4 番茄Hsp90基因的保守基序分布及序列分析

將番茄Hsp90基因氨基酸序列保存為FASTA格式文件，利用MEME(http://meme.nbcr.net/meme/cgibin/meme.cgi)在線工具對(duì)番茄 Hsp90基因進(jìn)行保守基序分布及序列分析。用DNAMAN6.0軟件分析序列之間的相似性。

1.2.5 番茄、擬南芥和水稻Hsp90基因家族比較分析

將獲得的擬南芥、水稻和番茄Hsp90基因的氨基酸序列保存為FASTA格式文件，通過軟件Clustal X 對(duì) Hsp90基因進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)[17]，利用MEGA 5.0軟件的鄰接法(Neighbor-Joining)對(duì)擬南芥、水稻和番茄Hsp90基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建[18]，Bootstrap值為1000，去除Bootstrap支持率低于60%的節(jié)點(diǎn)。

1.2.6 基于RNA-seq數(shù)據(jù)的表達(dá)分析

在番茄功能基因組數(shù)據(jù)庫(http://ted.bti.cornell. edu/cgi-bin/TFGD/digital/home.cgi)中下載D004栽培番茄各組織RNA-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)，并搜尋番茄Hsp90基因表達(dá)數(shù)據(jù)，利用軟件MeV[19]分析Hsp90基因的表達(dá)模式。

1.2.7 番茄Hsp90基因啟動(dòng)子序列鑒定及分析

從番茄基因組網(wǎng)站(http://solgenomics.net)下載所鑒定的7個(gè)Hsp90基因上游序列1.5 kb，通過在線軟件Plant CARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/)進(jìn)行分析。

1.2.8 番茄材料處理、Hsp90基因特異性引物設(shè)計(jì)及qRT-PCR檢測(cè)體系

對(duì)番茄材料 7818D進(jìn)行熱脅迫(42℃)處理，取熱激處理0 h、1.5 h、3 h、6 h、12 h和24 h的葉片為材料，3次生物學(xué)重復(fù)。根據(jù)總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)的說明書提取RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳儀檢測(cè)RNA的純度，-70℃保存。利用cDNA第1鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)，取 2 μL總 RNA，按照說明書進(jìn)行cDNA第1鏈的合成。

運(yùn)用BioXM 2.6軟件設(shè)計(jì)番茄Hsp90基因特異引物，由上海英俊生物公司合成。引物信息詳見表1。

表1 番茄HSP90基因引物

熒光定量 PCR擴(kuò)增體系為 20 μL，包括：2× TransStartTMEco Green qPCR SuperMix 10 μL，Passive Reference Dye 0.4 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7.8 μL。熒光定量PCR擴(kuò)增條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，55℃ 15 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)。運(yùn)用 2-ΔΔCt方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄Hsp90基因家族的鑒定

通過對(duì)番茄基因組數(shù)據(jù)庫的檢索，共鑒定出 7個(gè)Hsp90基因，分別命名為Hsp90-1～Hsp90-7(表2)。由表2可以看出，編碼氨基酸長度在267～794aa之間，氨基酸數(shù)目最多的為 Hsp90-4(Solyc07g0477-90.2.1)，含794個(gè)氨基酸，其次是Hsp90-2(Solyc05g-010670.2.1)，含 787個(gè)氨基酸；而編碼氨基酸數(shù)目最少的為 Hsp90-6(Solyc10g078930.1.1)，僅含 267個(gè)氨基酸；分子量大小由31.30～90.43 kDa不等，其中Hsp90-4的分子量最大，高達(dá)90.43 kDa，最小的為Hsp90-6，僅31.30 kDa；番茄Hsp90基因的等電點(diǎn)變化位于4.94～8.18之間，等電點(diǎn)最高的為Hsp90-6基因，最低的是Hsp90-2基因，除Hsp90-6基因外，其余基因所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)皆在6以下，表明大部分番茄Hsp90蛋白為酸性。

2.2 番茄Hsp90基因聚類及內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)分析

本研究運(yùn)用MEGA5.0軟件對(duì)番茄Hsp90基因的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7個(gè)Hsp90基因被明顯的分成4個(gè)分枝，除Hsp90-6外，Hsp90-1與Hsp90-3、Hsp90-5與Hsp90-7、Hsp90-2與Hsp90-4都分別聚類在同一分枝(圖1)。此外，本研究利用番茄基因組數(shù)據(jù)庫信息，通過在線工具GSDS繪制Hsp90基因的結(jié)構(gòu)模式圖(圖1)。如圖1所示： Hsp90基因的內(nèi)含子數(shù)目變化程度較大。其中內(nèi)含子數(shù)目最多的為Hsp90-4，含有19個(gè)內(nèi)含子，其次是Hsp90-2，含18個(gè)內(nèi)含子，且被聚為同一分枝，表明這兩個(gè)基因的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，而其余 5個(gè)番茄 Hsp90基因的內(nèi)含子數(shù)目皆為 2，基因結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單。

2.3 番茄Hsp90基因定位

通過番茄基因組數(shù)據(jù)庫信息，利用 MapDraw V2.1軟件將鑒定的番茄7個(gè)Hsp90基因定位于6條染色體上(圖2)， Hsp90-1～ Hsp90-7分別位于3、5、6、7、7、4和12號(hào)染色體上，除Hsp90-4和Hsp90-5基因位于同一染色體上，其余 5個(gè)基因分別位于不同的番茄染色體，其中Hsp90-1、Hsp90-2和Hsp90-7基因位于染色體的上端，Hsp90-4、Hsp90-5和Hsp90-6則位于染色體下端。通過在線網(wǎng)站(http://chibba.agtec.uga.edu/duplication/index/locus)研究發(fā)現(xiàn)，兩對(duì)基因(Hsp90-1和Hsp90-3，Hsp90-5和 Hsp90-7)所在區(qū)域(500 kb范圍內(nèi))存在共線性關(guān)系，前者發(fā)生了倒位現(xiàn)象，而后者基因排列順序相同，因此，這兩對(duì)基因在進(jìn)化過程中發(fā)生了片段重復(fù)。

2.4 番茄Hsp90基因的保守基序分布及序列分析

圖1 番茄Hsp90基因家族成員系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)綠色線條為外顯子，黑色細(xì)線為內(nèi)含子區(qū)，藍(lán)色粗線為非編碼區(qū)。

圖2 番茄Hsp90基因的染色體定位

利用MEME在線工具對(duì)番茄Hsp90基因進(jìn)行保守基序分析，結(jié)果顯示：番茄Hsp90基因含有15個(gè)保守基序，這些保守基序的長度為15～50aa(表3)，其中6個(gè)保守基序都包含50個(gè)氨基酸，分別是Motif 1、3、4、5、6和8，含有氨基酸數(shù)目最少的為Motif 13，僅含有15個(gè)氨基酸。通過Pfam在線軟件對(duì)15個(gè) Motif的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果顯示 Motif5、7、2和8共同組成了番茄Hsp90蛋白的ATPase結(jié)構(gòu)域，而其余 11個(gè) Motif共同組成了 Hsp保守域。僅Hsp90-1、Hsp90-5和Hsp90-7等3個(gè)基因中存在Hsp蛋白C端結(jié)構(gòu)域的MEEVD保守結(jié)構(gòu)，因此，保守基序分析未能顯示C端結(jié)構(gòu)。此外，序列相似性分析發(fā)現(xiàn)，Hsp90-5和Hsp90-7序列相似性最高，達(dá)到96.0%，Hsp90-5和Hsp90-6序列相似性最低，僅為19.0%，剩下的基因之間相似性位于19.4%～95.4%之間，表明番茄Hsp90蛋白之間具有較高的序列多樣化。

本文進(jìn)一步分析了番茄Hsp90蛋白15個(gè)基序的保守程度(圖 3A)。結(jié)果顯示：Hsp90-6蛋白僅含 3個(gè)保守基序，即Motif9、Motif11和Motif12。這表明此蛋白序列可能存在缺失。除Hsp90-3的Motif 11和12丟失外，其余5個(gè)番茄Hsp90蛋白都含有15個(gè)保守基序；除Hsp90-2和Hsp90-4中Motif 8的保守性相對(duì)較低外，其他基序的保守程度均較高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)15個(gè)保守基序中，氨基酸序列保守性較高的為Motif 8(圖3B)，這一基序除第8、23、24、27、34、35和 37個(gè)氨基酸處有一定變化外，其余位置氨基酸均完全保守。而含50個(gè)氨基酸的Motif 1的氨基酸序列保守性較低，其中許多位置的氨基酸多樣性程度較高，如第3、6、7個(gè)氨基酸位置處。

表3 番茄Hsp90蛋白的基序組成

2.5 番茄、擬南芥和水稻Hsp90基因家族比較分析

為深入分析番茄Hsp90基因的進(jìn)化關(guān)系，本研究選取擬南芥、水稻和番茄的Hsp90基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，參與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的Hsp90基因共23個(gè)，其中來自番茄和擬南芥的均為7個(gè)，來自水稻的為9個(gè)。從圖4中可以明顯看出，這些基因可分為5個(gè)亞枝，分別命名為Class A～Class F。除Class C和Class F亞分枝外，其余進(jìn)化枝都包含3種植物的Hsp90基因?；驍?shù)目最多的為Class A亞枝，含7個(gè)Hsp90基因，最少的為Class F亞枝，僅含兩個(gè)基因。本研究共發(fā)現(xiàn)14個(gè)Hsp90基因具有同源關(guān)系，約占基因總數(shù)目的60.86%(14/23)。物種間存在3對(duì)直系同源基因(AtHsp90-7和 Os06g50300、AtHsp90-6和Hsp90-4、Hsp90-6和Os09g30438)。而物種內(nèi)存在 4對(duì)旁系同源基因，2對(duì)(Hsp90-5和Hsp90-7，Hsp90-1和 Hsp90-3)來自于番茄，2對(duì)(Os08g39140和Os09g30418，Os08g38086和Os09g-29840)來自于水稻。育過程中的表達(dá)模式，本研究利用番茄功能基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站中 RNA-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)庫(D004)，分析Hsp90基因的表達(dá)模式(圖 5)。結(jié)果顯示：Hsp90-5基因在根、葉、花、花芽以及果實(shí)不同發(fā)育階段表達(dá)水平較高；Hsp90-7基因除在葉片中表達(dá)量相對(duì)較低外，其余組織中均高表達(dá)；Hsp90-6基因在參與表達(dá)分析的番茄各組織中表達(dá)量均較低；此外，本研究還發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)色期10 d的果實(shí)中，Hsp90-4基因表達(dá)水平較低，其余5個(gè)基因均具有高的表達(dá)量；大部分基因在葉片中的表達(dá)量較低；基因 Hsp90-2和Hsp90-3在幼果生長過程(1～3 cm)中表達(dá)量呈現(xiàn)出先上升后降低的趨勢(shì)，其中Hsp90-3基因在2 cm幼果和轉(zhuǎn)色10 d的果實(shí)中表達(dá)水平較高，而在其他組織器官中表達(dá)量較低；Hsp90-4基因除在轉(zhuǎn)色 10 d的果實(shí)中有少量表達(dá)外，在其余組織中表達(dá)量均較低。

圖3 番茄Hsp90蛋白保守基序分布及部分基序保守性分析A：保守基序分布；B：Motif 1和Motif 8 保守性分布。

圖4 番茄、擬南芥和水稻Hsp90基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系將擬南芥、水稻、番茄的23個(gè)Hsp90基因分成6類，分別為Class A～Class F。2.6 番茄Hsp90基因表達(dá)分析為揭示番茄Hsp90基因在不同組織以及果實(shí)發(fā)

圖5 番茄Hsp90基因表達(dá)分析紅色表示高表達(dá)量，綠色表示低表達(dá)量。

表4 番茄Hsp90基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件種類及數(shù)目

2.7 番茄Hsp90基因啟動(dòng)子分析

本研究運(yùn)用Plant CARE在線軟件對(duì)Hsp90基因啟動(dòng)子序列(上游1.5 kb)進(jìn)行分析(表4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，主要存在3類順式作用元件，包括非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)作用元件、激素應(yīng)答順式作用元件以及植物抗性脅迫反應(yīng)相關(guān)作用元件。非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)作用元件主要有：與熱脅迫相關(guān)的 HSE和CCAAT-box元件，與低溫應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的LTR元件，干旱脅迫相關(guān)作用元件MBS。各種激素應(yīng)答順式作用元件主要有：乙烯反應(yīng)作用元件(ERE)，脫落酸作用反應(yīng)元件(ABRE)，水楊酸作用反應(yīng)元件(TCA-element)，赤霉素作用反應(yīng)元件(GARE-motif)，茉莉酸甲酯作用元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)，植物激素反應(yīng)作用元件(TGA-box)。植物抗性脅迫反應(yīng)相關(guān)作用元件主要有：TC-rich repeats元件。在參與分析的7個(gè)基因中，除Hsp90-2外，其余5個(gè)基因均含有HSE元件，其中Hsp90-4含有的HSE元件數(shù)目多達(dá)5個(gè)。

2.8 番茄Hsp90基因在高溫脅迫下的表達(dá)模式

為了進(jìn)一步明確番茄Hsp90基因是否應(yīng)答高溫脅迫反應(yīng)，本文運(yùn)用qRT-PCR分析了番茄葉片在熱激處理?xiàng)l件下Hsp90基因的表達(dá)情況(圖6)。結(jié)果表明：所有基因在高溫不同處理時(shí)間段內(nèi)均有不同程度的表達(dá)，其中 Hsp90-1、Hsp90-4、Hsp90-5和Hsp90-7基因在葉片熱激達(dá)到12 h時(shí)，表達(dá)量最高；Hsp90-2和Hsp90-3基因在熱激3 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，并且它們的表達(dá)趨勢(shì)相近，但基因 Hsp90-2的表達(dá)量在處理3 h時(shí)呈現(xiàn)為急劇增加趨勢(shì)，而Hsp90-3基因的表達(dá)量增加則更為緩慢。Hsp90-6基因在處理3 h時(shí)表達(dá)量顯著增高，在6 h時(shí)有所降低，隨后又持續(xù)增高。

3 討 論

高溫脅迫通常會(huì)引起生物體內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)變化，其中熱激蛋白(Hsp)為生物體在高溫脅迫條件下迅速合成的一類保守蛋白，該蛋白最早發(fā)現(xiàn)于果蠅唾液腺染色體[20]。已有研究表明，當(dāng)植物經(jīng)過高溫脅迫后，植物可對(duì)致死高溫產(chǎn)生耐受性[21]，其中熱激蛋白起到了重要作用。另外，低溫、干旱、重金屬、鹽堿、ABA等都可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生Hsp[22]。目前，研究者根據(jù)Hsp分子量大小，將其分為Hsp60、Hsp70/ Hsp80、Hsp90、Hsp110和小分子量Hsp(smHsp)[6]，其中Hsp90是一類重要的熱激蛋白，具有高度的保守性，參與調(diào)控與維持細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)的構(gòu)象和功能[9]。有研究證實(shí) Hsp90基因參與了脅迫信號(hào)的傳遞和類固醇激酶受體、激酶和轉(zhuǎn)錄因子的折疊等生理生化過程[3,23～25]。因此，Hsp90基因具有功能多樣化特點(diǎn)。番茄是我國蔬菜產(chǎn)業(yè)中的主要作物，且設(shè)施栽培面積較廣，番茄耐熱研究已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。番茄Hsp90基因的鑒定將有利于全面揭示該基因的潛在功能，同時(shí)也為植物Hsp90基因的進(jìn)化分析等研究提供依據(jù)。2012年，番茄全基因組測(cè)序已經(jīng)完成[15]，這將為人們?cè)谌蚪M水平上鑒定番茄Hsp90基因家族成員提供條件。

圖6 番茄Hsp90基因高溫脅迫下的表達(dá)模式

本研究共鑒定出7個(gè)番茄Hsp90基因(表2)。它們所編碼的氨基酸序列長度位于276～794 aa之間，等電點(diǎn)集中在4.00～8.18范圍內(nèi)，除Hsp90-6外，大部分番茄Hsp90蛋白皆為酸性。番茄Hsp90基因不均勻的分布于番茄染色體上，主要集中于染色體的兩端(圖2)，這與水稻Hsp90基因分布情況類似[14]。目前，水稻和擬南芥的比較研究證實(shí)基因重復(fù)是基因家族進(jìn)化過程中的重要機(jī)制之一[4,26～27]。本研究中，兩對(duì)番茄Hsp90基因(Hsp90-1和Hsp90-3，Hsp90-5和 Hsp90-7)位于染色體片段重復(fù)區(qū)段，表明番茄Hsp90基因在進(jìn)化過程中可能發(fā)生了基因復(fù)制現(xiàn)象。番茄 Hsp90基因的保守基序分析顯示，Hsp90-6僅含3個(gè)保守基序，這表明該基因在進(jìn)化過程中可能發(fā)生了部分序列的丟失。除Hsp90-6外，僅Hsp90-3存在兩個(gè)保守基序的缺失，而其余5個(gè)Hsp90基因家族成員所編碼的氨基酸序列均高度保守(圖3)，這與前人對(duì) Hsp90基因的描述相符[9]。Motif5、7、2和 8共同組成了的 ATPase結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?yàn)锳TP/ADP結(jié)合位點(diǎn)，具有 ATPase活性[4]，而其余11個(gè) Motif共同組成的 Hsp保守域在維持 ATPase結(jié)構(gòu)域的完整活性中具有關(guān)鍵作用[28]。番茄 Hsp90基因中僅Hsp90-1、Hsp90-5和Hsp90-7等3個(gè)基因具有MEEVD保守結(jié)構(gòu)，這表明番茄Hsp蛋白的C端結(jié)構(gòu)域多樣性程度較高。

通過擬南芥、水稻和番茄Hsp90基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)3對(duì)直系同源基因和4對(duì)旁系同源基因，其數(shù)目約占基因總數(shù)目的 60.86%(14/23)，表明這些基因在番茄、水稻和擬南芥基因組中，以各自物種特異的方式進(jìn)行了擴(kuò)展，這種現(xiàn)象也普遍出現(xiàn)于其他植物基因家族研究中[29,30]。基于 RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，Hsp90基因在番茄不同組織中的表達(dá)量具有顯著性差異，其中 Hsp90-5在根、葉、芽、花和果實(shí)不同發(fā)育階段中表達(dá)量均較高，這表明該基因與番茄植株正常生理生化活動(dòng)聯(lián)系緊密。除Hsp90-4和Hsp90-6基因外，其余5個(gè)基因在果實(shí)中都具有顯著的表達(dá)量，這暗示著它們可能參與了番茄果實(shí)的生長和發(fā)育。Hsp90-2和Hsp90-3基因在幼果生長過程中表達(dá)量呈現(xiàn)出先升高后降低的狀態(tài)，這表明該基因可能參與果實(shí)發(fā)育的相關(guān)調(diào)控過程。qRT-PCR研究發(fā)現(xiàn)，Hsp90基因在番茄葉片熱處理?xiàng)l件下表達(dá)量均有所升高，但其變化趨勢(shì)存在差異，這表明Hsp90蛋白可能參與番茄葉片對(duì)高溫逆境脅迫的應(yīng)答。

此外，還發(fā)現(xiàn)在每一個(gè)番茄Hsp90基因啟動(dòng)子序列中均含有與非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件(表 4)，其中 HSE已被證實(shí)為植物應(yīng)對(duì)熱脅迫的作用元件，而CCAAT-box具有增加熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性[31,32]，大部分的番茄 Hsp90基因啟動(dòng)子均含有HSE。此外，Hsp90基因還含有其他作用元件，如激素反應(yīng)和抗病反應(yīng)相關(guān)作用元件，表明這類基因可能還參與了番茄應(yīng)對(duì)激素脅迫和生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，這些結(jié)果將為進(jìn)一步分析番茄Hsp90基因的作用機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。然而，本文未發(fā)現(xiàn)番茄Hsp90基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件及其數(shù)目與基因的實(shí)際表達(dá)量存在明確的相關(guān)性。而引起這一現(xiàn)象的原因可能存在以下 3個(gè)方面。首先，基因表達(dá)的調(diào)控與多種因素相關(guān)，如空間、時(shí)間調(diào)控等模式[33]；其次，目前還有許多順式作用元件還未能鑒定出來，存在被忽略的可能性[34]；最后，順式作用元件還存在多樣性，它們所調(diào)控基因產(chǎn)生不同的功能，而這通常引起植株的不同表型[35]。

[1] Ahuja I, de Vos RC, Bones AM, Hall RD. Plant molecular stress responses face climate change. Trends Plant Sci, 2010, 15(12): 664-674.

[2] Heckathorn SA, Ryan SL, Baylis JA, Wang D, Hamilton III EW, Cundiff L, Luthe DS. In vivo evidence from an Agrostis stolonifera selection genotype that chloroplast small heat-shock proteins can protect photosystem II during heat stress. Funct Plant Biol, 2002, 29(8): 935-946.

[3] Wegele H, Müller L, Buchner J. Hsp70 and Hsp90-a relay team for protein folding. Rev Physiol Biochem Pharmacol, 2004, 151: 1-44.

[4] Young JC, Moarefi I, Hartl FU. Hsp90: a specialized but essential protein-folding tool. J Cell Biol, 2001, 154(2): 267-274.

[5] Lindquist S. The heat-shock response. Annu Rev Biochem, 1986, 55(1): 1151-1191.

[6] Al-Whaibi MH. Plant heat-shock proteins: a mini review. J King Saud University-Sci, 2011, 23(2): 139-150

[7] Prasinos C, Krampis K, Samakovli D, Hatzopoulos P. Tight regulation of expression of two Arabidopsis cytosolic Hsp90 genes during embryo development. J Exp Bot, 2005, 56(412): 633-644.

[8] 裴麗麗, 徐兆師, 尹麗娟, 李連城, 陳明, 郭玉華, 馬有志. 植物熱激蛋白 90 的分子作用機(jī)理及其利用研究進(jìn)展. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2013, 14(1):109-114.

[9] Picard D. Heat-shock protein 90, a chaperone for folding and regulation. Cell Mol Life Sci, 2002, 59(10): 1640-1648.

[10] Pareek A, Singla SL, Grover A. Immunological evidence for accumulation of two high-molecular-weight (104 and 90 kDa) HSPs in response to different stresses in rice and in response to high temperature stress in diverse plant genera. Plant Mol Biol, 1995, 29(2): 293-301.

[11] Song HM, Fan PX, Li YX. Overexpression of organellar and cytosolic AtHSP90 in Arabidopsis thaliana impairs plant tolerance to oxidative stress. Plant Mol Biol Rep, 2009, 27(3): 342-349.

[12] Wang GF, Wei XN, Fan RC, Zhou HB, Wang XP, Yu CM, Dong LL, Dong ZY, Wang XJ, Kang ZS, Ling HQ, Shen QH, Wang DW, Zhang XQ. Molecular analysis of common wheat genes encoding three types of cytosolic heat shock protein 90 (Hsp90): functional involvement of cytosolic Hsp90s in the control of wheat seedling growth and disease resistance. New Phytol, 2011, 191(2):418-431.

[13] Krishna P, Gloor G. The Hsp90 family of proteins in Arabidopsis thaliana. Cell stress Chaperon, 2001, 6(3): 238-246.

[14] Hu WH, Hu GC, Han B. Genome-wide survey and expression profiling of heat shock proteins and heat shock factors revealed overlapped and stress specific response under abiotic stresses in rice. Plant Sci, 2009, 176(4):583-590.

[15] The Tomato Genome Consortium. The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution, Nature, 2012, 485(7400): 635-641.

[16] 郭安源, 朱其慧, 陳新, 羅靜初. GSDS: 基因結(jié)構(gòu)顯示系統(tǒng). 遺傳, 2007, 29(8): 1023-1026.

[17] Chenna R, Sugawara H, Koike T, Lopez R, Gibson TJ, Higgins DG, Thompson JD. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acids Res, 2003, 31(13): 3497-3500.

[18] Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol, 2011, 28(10): 2731-2739.

[19] Mohr P, Iliadis C. Recommended cross-section of the reaction below 2.5 MeV: A potential tool for quantitative analysis and depth profiling of oxygen. Nucl Instrum Meth A, 2012, 688(1): 62-65.

[20] Tissiéres A, Mitchell HK, Tracy UM. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: Relation to chromosome puffs. J Mol Biol, 1974, 84(3): 389-398.

[21] 杜志如. 水稻熱激蛋白 Hsp90 基因的克隆及互作蛋白的篩選[學(xué)位論文]. 雅安: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[22] Vierling E. The roles of heat shock proteins in plants. Annual Review of Plant Biology, 1991, 42(1): 579-620

[23] Jackson SE, Queitsch C, Toft D. Hsp90: from structure to phenotype. Nat Struct Mol Biol, 2004, 11(12): 1152-1155.

[24] Shinozaki F, Minami M, Chiba T, Suzuki M, Yoshimatsu K, Ichikawa Y, Terasawa K, Emori Y, Matsumoto K, Kurosaki T, Nakai A, Tanaka K, Minami Y. Depletion of Hsp90β induces multiple defects in B cell receptor signaling. J Biol Chem, 2006, 281(24): 16361-16369.

[25] Zuehlke A, Johnson JL. Hsp90 and co-chaperones twist the functions of diverse client proteins. Biopolymers, 2010, 93(3): 211-217.

[26] Yang Z, Wang X, Gu S, Hu Z, Xu H, Xu C. Comparative study of SBP-box gene family in Arabidopsis and rice. Gene, 2008, 407(1-2): 1-11.

[27] Yang ZF, Zhou Y, Wang XF, Gu SL, Yu JM, Liang GH, Yan CJ, Xu CW. Genomewide comparative phylogenetic and molecular evolutionary analysis of tubby-like protein family in Arabidopsis, rice, and popla. Genomics, 2008, 92(4): 246-253.

[28] Meyer P, Prodromou C, Hu B, Vaughan C, Roe SM, Panaretou B, Piper P W, Pearl LH. Structural and functional analysis of the middle segment of hsp90: implications for ATP hydrolysis and client protein and cochaperone interactions. Mol Cell, 2003, 11(3): 647-658.

[29] Jain M, Tyagi AK, Khurana JP. Genome-wide analysis, evolutionary expansion, and expression of early auxinresponsive SAUR gene family in rice (Oryza sativa). Genomics, 2006, 88(3): 360-371.

[30] Zhang SB, Chen C, Li L, Meng L, Singh J, Jiang N, Deng XW, He ZH, Lemaux PG. Evolutionary expansion, gene structure, and expression of the rice wall-associated kinase gene family. Plant Physiol, 2005, 139(3): 1107-1124.

[31] Haralampidis K, Milioni D, Rigas S, Hatzopoulos P. Combinatorial interaction of cis elements specifies the expression of the Arabidopsis AtHsp90-1 Gene. Plant Physiol, 2002, 129(3): 1138-1149.

[32] Czarnecka E, Key J L, Gurley W B. Regulatory domains of the Gmhspl 7.5 heat shock promoter of soybean. Mol Cell Biol, 1989, 9(8): 3457-3463.

[33] Banerjee N, Zhang MQ. Functional genomics as applied to mapping transcription regulatory networks. Curr Opin Microbiol, 2002, 5(3): 313-317.

[34] Higo K, Ugawa Y, Iwamoto M, Korenaga T. Plant cis-acting regulatory DNA elements (PLACE) database: 1999. Nucleic Acids Res, 1999, 27(1): 297-300.

[35] Brown CD, Johnson DS, Sidow A. Functional architecture and evolution of transcriptional elements that drive gene coexpression. Science, 2007, 317(5844): 1557-1560.

(責(zé)任編委: 李傳友)

Genome-wide identification and analysis of heat shock protein 90 in tomato

Yunfei Liu1,2, Hongjian Wan1, Yuejian Yang1, Yanping Wei1,2, Zhimiao Li1, Qingjing Ye1, Rongqing Wang1, Meiying Ruan1, Zhuping Yao1, Guozhi Zhou1

1. Institute of Vegetables, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China;
2. College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

Abstract:Heat shock proteins 90 (Hsp90) are a kind of specific proteins in plant which were produced under environmental stresses. By referring to the tomato genome database, we identified and analyzed Hsp90 gene family members using bioinformatics methods. Results indicated that the tomato genome contained at least 7 Hsp90 genes, which were distributed unevenly on 6 chromosomes. Amino acid sequence length of these proteins ranged from 267 to 794aa. Numbers of intron ranged from 2 to 19. Microsynteny analysis showed that two pairs of Hsp90 genes (Hsp90-1and Hsp90-3, Hsp90-5 and Hsp90-7) were identified by segment duplication. In addition, multiple conservation motifs were found in Hsp90 proteins. Phylogenetic analysis revealed that Hsp90 genes from tomato, rice and Arabidopsis can be divided into 5 groups. Three pair of orthologous genes and four pairs of homologous genes were found. Expression analysis based on RNA-seq showed that the expression of three genes (Hsp90-5, Hsp90-6 and Hsp90-7) was high in vegetable and reproductive organs, while the expression of other four genes (Hsp90-1, Hsp90-2, Hsp90-3 and Hsp90-4) was relatively low except for its expression at the breaking stage of fruit. Analysis of promoter regions of Hsp90 genes showed that multiple cis-elements were involved in plant responses to biotic and abiotic stresses. The expression of 7 genes under heat stress was also detected by qRT-PCR. Expression of all Hsp90 genes in tomato leaf was enhanced. The results indicated that these genes could be participated in tomato leaf response to heat stresses. Together, these results will lay a foundation for analyzing Hsp90 gene function and molecular evolution in the future.

tomato; heat shock protein; gene duplication; expression analysis

2014-02-24;

2014-06-08

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31301774，31272156)，浙江省優(yōu)先主題農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(編號(hào)：2011C12004)，國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(編號(hào)：CARS-25-G-16)，浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(xiàng)(編號(hào)：2012C12903)，公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(編號(hào)：201003065)，國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2012BAD02B02)和浙江省蔬菜產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(編號(hào)：2009R50026)資助

劉云飛，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜學(xué)。Tel: 0571-86404352；E-mail: head_20074152@126.com

萬紅建，博士，副研究員，研究方向：番茄遺傳育種。E-mail: wanhongjian@sina.com

10.3724/SP.J.1005.2014.1043

時(shí)間: 2014-9-2 10:35:55

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140911.1047.003.html