大豆蛋白酶解過程中聚集行為的研究

趙沙沙 孔祥珍 蘇 芮 華欲飛

(江南大學(xué)食品學(xué)院食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，無錫 214122)

大豆以及大豆產(chǎn)品如豆?jié){、豆腐等具有豐富的營養(yǎng)價值。大豆中的蛋白質(zhì)主要包括儲藏蛋白和生理活性蛋白，其中儲藏蛋白中約65%為大豆球蛋白(glycinin)，35%為 β－伴球蛋白(β－conglycinin)［1］，根據(jù)其沉降系數(shù)分別又稱作11S和7S。11S分子質(zhì)量為340～375 ku，主要由酸性亞基(A1、A2、A3、A4、A5和 A6)和堿性亞基(B1、B2、B3、B4、B5和B6)通過二硫鍵連接形成(A4酸性亞基除外)。7S分子質(zhì)量為180～210 ku，主要由α、α'和β 3種亞基組成［2］。

對大豆蛋白進行酶水解是一種提高其功能性質(zhì)的有效方法。水解后可以提高大豆蛋白的溶解性、乳化性、起泡性［3］。但是另一方面，水解卻帶來了一個弊端，即在水解過程中會形成不溶性聚集體，使得大豆蛋白的水溶性降低，從而降低了得率。目前，大豆分離蛋白、大豆球蛋白酶解過程的聚集現(xiàn)象研究已較多，對于酶解過程中聚集機理研究也較為透徹［4－6］。但是，在酶解過程中大豆球蛋白以及β－伴球蛋白各自所起的作用以及β－伴球蛋白對大豆球蛋白酶解過程的聚集的影響卻鮮有報道。Kuipers等［7］對大豆蛋白的酶解聚集方面進行了研究，即制備不同水解度的酶解物，研究酶解物在不同pH下的溶解情況，以期獲得7S、11S酶解物對聚集的作用。

本研究在Kuipers等［7］的研究基礎(chǔ)上，從另一角度出發(fā)，主要通過監(jiān)測酶解液的濁度變化研究不同大豆蛋白(7S、11S、SPI即大豆分離蛋白)在酶解過程中的聚集現(xiàn)象，通過與模擬濁度值比較更直觀地獲得7S/11S不同比例的蛋白在酶解過程中的聚集行為，并采用液相色譜法以及電泳技術(shù)探究酶解過程中7S和11S酶解物對聚集的貢獻，并以此初步探究酶解過程中7S酶解物對11S酶解物聚集的抑制機理。

1 材料與方法

1.1 材料

脫脂豆粕:山東萬德福有限公司;堿性蛋白酶(Alcalase):諾維信生物技術(shù)有限公司;苯甲基磺酰氟(PMSF):生工生物工程(上海)股份有限公司;乙腈，色譜純:國藥;其余試劑均為分析純。

1.2 儀器及設(shè)備

高效液相儀、LGJ－10高速冷凍離心機:日本日立公司;LGJ型冷凍干燥機:北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;DYY－8C電泳儀:北京六一儀器廠;GX－2005循環(huán)水浴鍋:上海比朗儀器有限公司;868型pH計:上海熱電儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大豆蛋白的制備

大豆蛋白的提取采用Nagano等［8］法并稍作改良。醇洗脫脂豆粕按1∶10的料液比加入去離子水，充分溶解后，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至7.0，室溫下低速攪拌1 h，以10 000 r/min，4℃下離心30 min，棄去沉淀，上清液用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)至4.5，以10 000 r/min，4℃下離心30 min，棄去上清液，得到的蛋白質(zhì)凝乳使用大體積去離子水洗3次除去殘留的鹽離子。得到的凝乳加入少量去離子水并用2 mol/L NaOH將溶液回調(diào)至7.0，經(jīng)攪拌充分溶解后，溶液在10 000 r/min離心30 min以棄去少量不溶物質(zhì)，上清液經(jīng)冷凍干燥，干燥的大豆分離蛋白在4℃條件下保存。11S的提取過程與SPI的提取方法類似，具體步驟見圖1。

圖1 大豆蛋白(SPI、11S、7S)的提取工藝流程圖

1.3.2 Alcalase 水解大豆蛋白

大豆蛋白10%溶于pH 8.0的去離子水中，常溫下攪拌2 h，充分溶解后于19 000 r/min離心30 min以除去少量不溶性物質(zhì)。離心后取上清液，凱氏定氮測定溶液中蛋白濃度，此溶液為母液，每次酶解前均需新鮮配制。將此溶液準(zhǔn)確稀釋至蛋白濃度為2%，置于200 mL的酶解器中，于60℃預(yù)熱攪拌10 min，加入Alcalase進行酶解。其中，底物與酶的比例為100∶1。酶解至一定水解度后，加入酶抑制劑PMSF，使其終濃度為1 mmol/L，終止反應(yīng)。取酶解液于19 000 r/min離心30 min，以獲得水溶性成分和水不溶性成分，其中水不溶性成分即為酶解過程中產(chǎn)生的聚集體。

1.3.3 水解度的測定

水解度的測定采用pH－stat法［9］。水解過程中逐漸滴加0.1 mol/L的NaOH以維持Alcalase的最適pH 8.0。其中水解度(DH)的計算公式為:式中:B為NaOH的體積/mL;Nb為NaOH的濃度，0.1 mol/L;1/α為α－氨基的平均解離度(60℃，pH 8.0條件下為1.08);Mp為溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量/g;htot為底物中肽鍵的含量/meqv/g蛋白。

1.3.4 濁度的測定

酶解液的濁度變化采用分光光度計監(jiān)控。用spectrumlab22PC分光光度計在室溫下操作，載樣的比色皿為厚度1 mm的玻璃比色皿。每隔一段時間取出一定量的酶解液于660 nm下測定溶液的吸光度。

1.3.5 聚集物干物質(zhì)產(chǎn)率的測定

當(dāng)水解結(jié)束后，加入PMSF終止反應(yīng)。取出一定量溶液，準(zhǔn)確稱其質(zhì)量，記為m1，置于105℃烘箱中烘干，恒重后稱其質(zhì)量為m2;另取一部分溶液，準(zhǔn)確稱其質(zhì)量為m3，并于19 000 r/min離心30 min，棄去上清，得沉淀于105℃烘箱恒重至m4。聚集物占總蛋白干基的比率計算公式為:

1.3.6 高效液相測定酶解液分子質(zhì)量分布

采用高效液相色譜法(HPLC)測定酶解后水溶性成分和水不溶性聚集體的分子質(zhì)量分布。上清液溶于純水中，水不溶性成分溶于8 mol/L鹽酸胍或30 mmol/L DTT中，樣品濃度均為10 mg/mL。色譜柱:TSKgel2 000SWXL 300 mm × 7.8 mm(Tosoh，Tokyo，Japan);流動相:乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1;檢測波長:UV(220 nm);流速:0.5 mL/min;柱溫:30℃;分子質(zhì)量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品:細胞色素C(MW 12 500 u)，抑菌肽(MW 6 500 u)，桿菌肽(MW 1 450 u)，Gly－Gly－Arg－Tyr(MW 451 u)，Gly－Gly－Gly(MW 189 u)。

1.3.7 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)分析

SDS－PAGE凝膠電泳法參照Laemmli法［10］。分離膠和濃縮膠濃度分別為12.5%和4%，恒流電泳，電流先調(diào)至10 mA，待樣品進入濃縮膠后調(diào)至30 mA。樣品為不同水解度的上清液和水不溶性聚集體。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同大豆蛋白Alcalase酶解液聚集的觀察

溶液在可見光范圍內(nèi)的吸光度可以作為樣品溶液中顆粒大小和濃度的測定指標(biāo)［11］，因此，測定大豆蛋白溶液酶解過程中的吸光度，可以動態(tài)地跟蹤水解過程蛋白質(zhì)及聚集物的濃度和大小的變化趨勢。11S、SPI以及7S使用Alcalase進行酶解，底物濃度均為2%，底物與酶的比例為100∶1。由圖2可以看出，在相同蛋白濃度下使用Alcalase進行酶解時，11S的濁度增加要比7S、SPI劇烈，11S酶解液的濁度在較短時間內(nèi)(18 min)就達到了最大值，達到最大值之后濁度緩慢減小。濁度的變化說明酶解過程可以分為2個階段:第1階段為濁度上升的階段，在這一階段小分子肽段的聚集要快于酶對蛋白和聚集體的降解，可以認為酶對蛋白的降解是這一階段的限速反應(yīng);第2階段為濁度下降的階段，在這一階段酶對蛋白和聚集體的降解快于肽的聚集，從而導(dǎo)致了濁度的下降。

與11S相比，SPI的聚集程度明顯降低，而且聚集開始的時間(第55 min)也比11S延遲很多，從濁度開始上升到最大值出現(xiàn)所用的時間也較11S長。而7S的濁度自始至終(2 h內(nèi))都沒有明顯變化，這說明在2 h的酶解過程中，7S酶解物并沒有出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。比較三者可以得出，在蛋白濃度相同時，11S的Alcalase酶解物更易發(fā)生聚集，而且聚集物的產(chǎn)量也較大，但聚集產(chǎn)物并不穩(wěn)定，易于降解，SPI酶解過程中出現(xiàn)了輕微的聚集現(xiàn)象，而7S酶解物基本不會發(fā)生聚集。

圖2 不同蛋白Alcalase酶解時濁度變化曲線

2.2 不同11S/7S比例對聚集的影響

基于圖2中11S與7S酶解液濁度隨酶解時間的變化結(jié)果，模擬11S/7S不同比例的蛋白混合物的濁度隨酶解時間的變化情況(圖3)。所模擬的11S/7S的比例分別為 50∶1、25∶1、10∶1、5∶1 以及 1.76∶1。其中當(dāng)11S/7S為1.76:1時與SPI中11S/7S比例相當(dāng)。由圖3可以看出，隨著7S比例的增大，相同時刻的濁度值逐漸減小。

同時，對不同比例的11S/7S蛋白，采用Alcalase進行酶解，并對酶解物的濁度隨酶解時間的變化進行了試驗測定，結(jié)果如圖4所示。試驗通過固定11S的濃度和酶解溶液的體積，添加不同量的7S來完成。由于添加不同量的7S，導(dǎo)致總蛋白濃度發(fā)生了變化，但是7S的濃度始終未達到2%。由圖2可以看出，當(dāng)7S濃度為2%時，酶解時間在2 h之內(nèi)均未出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。由此可以忽略總蛋白濃度的變化對聚集的影響。隨著蛋白混合物中7S比例的增大，相同酶解時刻的濁度呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，并且濁度最大值出現(xiàn)的時間點隨7S/11S比例的增大而增大。假定7S與11S混合后，其酶解互不影響，那么酶解物濁度值隨酶解時間的變化應(yīng)該如圖3所示。但結(jié)合圖4的結(jié)果分析比較可知，不同比例7S和11S混合后酶解，酶解液實際的濁度測定結(jié)果要小于理論模擬值，并且濁度最大值出現(xiàn)的時間較模擬值推遲。這說明7S和11S混合酶解后，濁度的變化不單單是由于二者比例的變化從而造成濁度的下降，最主要的原因是由于添加7S與11S混合酶解，對酶解物的聚集產(chǎn)生了抑制。

圖3 11S/7S不同比例下濁度模擬圖

大豆分離蛋白中含有較高含量(約65%)的11S蛋白，在其酶解時發(fā)生的聚集程度較大，更容易發(fā)生聚集。若大豆蛋白中7S蛋白含量增大，整體蛋白的聚集現(xiàn)象減弱。在11S濃度不變的情況下，通過添加不同量的7S對11S酶解過程中肽的聚集有影響，即7S酶解物對11S酶解物聚集有一定的抑制作用，而且隨著7S添加量的增大，其抑制作用更為明顯。

圖4 不同比例11S/7S酶解過程中濁度變化曲線

定義濁度最大值時的吸光度為OD1，吸光值穩(wěn)定時的濁度為OD2。則ΔOD=OD1－OD2，ΔOD可以作為聚集物產(chǎn)量的一個指標(biāo)。由表1可以看出，隨著11S/7S比例的逐漸減小，OD1與OD2之間的差距即ΔOD逐漸縮小，這說明在酶解過程中的聚集體的產(chǎn)量隨7S添加量的增加而減小。而且，隨著11S/7S比例的減小，OD2呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢，這說明7S對11S酶解物的聚集有一定的抑制作用，并且對聚集物的穩(wěn)定性有一定的作用。11S/7S為1.76的濁度曲線與SPI的濁度曲線對比可以發(fā)現(xiàn)，相同時刻混合樣品(11S/7S=1.76)的濁度值要大于SPI的濁度值。

表1 不同11S/7S比例的OD值(660 nm)

2.3 聚集物產(chǎn)量的表征

對DH=5時不同比例的11S/7S酶解后不溶性聚集物的產(chǎn)量進行了測量。聚集物占總蛋白的比例見圖5。由圖5可以看出隨著11S/7S比例的減小，聚集物占總蛋白的比例也逐漸減小，這說明7S酶解產(chǎn)物對11S酶解產(chǎn)物的聚集有抑制作用，這與濁度檢測的結(jié)果是一致的。

圖5 不同比例11S/7S在DH=5聚集物產(chǎn)量占總蛋白的比(干基)

2.4 不同比例11S/7S水解產(chǎn)物的HP－SEC圖譜分析

采用HP－SEC對不同比例的11S/7S在DH=5時制備的酶解物上清液和不溶性聚集體的分子質(zhì)量進行表征，結(jié)果如表2～表4所示。其中上清液使用超純水溶解，樣品可以完全溶解。水不溶性聚集體使用8 mol/L鹽酸胍溶液可以完全溶解，使用30 mmol/LDTT不能完全溶解。由表2和表3對比可以看出，上清液中分子質(zhì)量分布主要集中于大于10 000 u以及5 000 u以下部分，而沉淀中組分的分子質(zhì)量主要集中于5 000 u以下。這說明上清液中既有大分子質(zhì)量的組分，也有小分子質(zhì)量的成分。而沉淀主要是一些小分子質(zhì)量的組分，這說明在酶解過程中形成聚集體主要是一些分子質(zhì)量較小的肽段。這與于鴻鵬等［12］的結(jié)論相符。沉淀中可以溶于30 mmol/L DTT溶液中的成分的分子質(zhì)量主要分布于5 000 u以下，約占90%。這說明DTT處理沉淀可以得到一些小分子質(zhì)量且可溶于水的親水性肽段。這些小肽以二硫鍵連接的形式結(jié)合在聚集體上。

表2 不同比例11S/7S上清液分子質(zhì)量分布/%

表3 不同比例11S/7S酶解不溶性聚集物分子質(zhì)量分布/%

表4 DTT處理不同比例11S/7S不溶性聚集物分子質(zhì)量分布/%

2.5 SDS－PAGE分析

不同比例的11S/7S酶解后進行離心，得到的上清液進行SDS－PAGE。圖6a中的條帶1是AB肽鏈聚合體，條帶2可能是酶解過程中產(chǎn)生的可溶性聚合體，條帶3為A5B3聚合體。區(qū)域1是在酶解過程中形成的一些小分子質(zhì)量肽段，與還原后的SDSPAGE(圖6b)相比，區(qū)域1基本消失，說明這些肽段含有二硫鍵，還原后形成了一些分子質(zhì)量更小的片段。由圖6b可以看出，7S的α'與α亞基已被完全降解，而β亞基仍有殘留，這說明β亞基不易被Alcalase降解。11S的A肽鏈有少許殘留，B肽鏈仍有較多的殘留。

圖6 上清液SDS－PAGE圖

3 結(jié)論

本研究表明，大豆中的7S、11S、SPI蛋白在使用Alcalase進行酶解時，產(chǎn)生的聚集現(xiàn)象不同。其中11S酶解物最易發(fā)生聚集，而SPI酶解物稍有聚集現(xiàn)象，但不明顯，而7S在酶解時基本不會有聚集現(xiàn)象發(fā)生。在改變7S與11S的比例進行酶解時發(fā)現(xiàn)，固定11S的濃度不變，隨著7S添加量的增大11S酶解物聚集現(xiàn)象有所減小，這說明7S酶解物對11S酶解物的聚集有抑制作用，而抑制的機理還需進一步探究。

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