腦損傷大鼠腦組織EB含量與Claudin-5表達(dá)的分析

張高煉 韋可聰 梁建平 謝偉星 朱云中 梁韡斌 周 慶 張曉寧 龔文勁（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,廣西 南寧 530023）

腦損傷大鼠腦組織EB含量與Claudin-5表達(dá)的分析

張高煉 韋可聰 梁建平 謝偉星 朱云中 梁韡斌 周 慶 張曉寧 龔文勁（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,廣西 南寧 530023）

目的研究黃芪對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷后腦EB含量和緊密連接相關(guān)蛋白claudin-5表達(dá)的影響。方法采用自由落體致傷原理制成大鼠腦損傷模型，伊文思藍(lán)法檢測(cè)BBB通透性，Western blot法檢測(cè)Claudin-5的表達(dá)。結(jié)果腦損傷模型組及黃芪組BBB通透性于腦損傷后明顯增加，同時(shí)黃芪組BBB通透性低于腦損傷模型組；Claudin-5的表達(dá)在腦損傷模型組和黃芪組于傷后明顯減少，黃芪組的表達(dá)明顯高于腦損傷模型組（P＜0.01）。結(jié)論調(diào)節(jié)緊密連接相關(guān)蛋白Claudin-5的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)BBB的通透性可能是黃芪抑制腦水腫形成的途徑之一。

腦水腫；黃芪；EB含量；Clandin-5

創(chuàng)傷性腦損傷簡(jiǎn)稱(chēng)TBI,作為臨床神經(jīng)外科中較為常見(jiàn)的一種疾病,其致殘率、病死率極高,因此探尋TBI對(duì)人體產(chǎn)生的影響有重要意義。目前,臨床上對(duì)TBI的主要研究機(jī)體顱腦遭遇損傷后,其繼發(fā)性損傷機(jī)制的病理性表現(xiàn)。黃芪是我國(guó)中醫(yī)治療缺血性腦血管疾病時(shí)較為常用的一種中藥,其具備改善腦部血液微循環(huán)、增強(qiáng)抗自由基作用等藥理作用已經(jīng)被現(xiàn)代藥理研究證實(shí)。而黃芪治療TBI臨床療效的相關(guān)研究文獻(xiàn)并不多見(jiàn),同時(shí)藥理學(xué)關(guān)于其作用機(jī)制也尚未明確。本文旨在分析黃芪與claudin-5表達(dá)之間的關(guān)系,現(xiàn)將研究?jī)?nèi)容報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料選取

隨機(jī)挑選70只成年雄性SD大鼠,體質(zhì)量均在200～260 g之間,選取大鼠均由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 材料型號(hào)

小鼠抗Claudin-5單克隆抗體由Santa Cruz公司生產(chǎn)；實(shí)驗(yàn)中使用的戊巴比妥鈉由美國(guó)Sigma生產(chǎn)；另外伊文思藍(lán)由Evans blue,EB,Fluka公司進(jìn)口分裝；山羊抗小鼠辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗由北京中山生物技術(shù)公司生產(chǎn),黃芪注射液由黑龍江省珍寶島制藥有限公司。

1.3 研究方法

①對(duì)照研究:將由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的70只成年雄性SD大鼠,依據(jù)數(shù)字標(biāo)記法隨機(jī)分成兩組,一組為對(duì)照組,另外一組為實(shí)驗(yàn)組（黃芪組）,兩組均給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)和自由飲水,保持室溫（20～25）°C及恒定的濕度。每組在隨機(jī)分為術(shù)后6 h、l d、3 d、5 d、7 d五個(gè)時(shí)相點(diǎn),各時(shí)間點(diǎn)均取6只大鼠分別進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。每組大鼠均在術(shù)后48 h內(nèi)取樣腦組織,并均給予Claudin-5蛋白表達(dá)情況和BBB通透性等檢查。②大鼠腦部創(chuàng)傷處理:本文兩組大鼠制作的動(dòng)物模型均參照Feeny等人制作大鼠創(chuàng)傷腦損傷模型方法對(duì)大鼠進(jìn)行處理:依據(jù)自由落體的物理原理,制作相關(guān)大鼠腦部撞擊裝置。兩組大鼠均給予濃度為4%水合氯醛300 mg/kg進(jìn)行腹腔麻醉；大鼠在實(shí)施麻醉后,將老鼠頭部放置在立體定向儀上,并做好固定處理；依據(jù)正中線(xiàn)將大鼠頭皮切開(kāi),并將其骨膜剝離,在前囟后3.5 mm進(jìn)行標(biāo)記,并使用牙科臺(tái)式電鉆進(jìn)行處理,在中線(xiàn)右旁2.5 mm處鉆出圓形骨窗,骨窗直徑在5 mm左右,并避免對(duì)硬腦膜造成損傷；隨后讓骨窗處與撞擊器上的撞桿頭保持在同一水平線(xiàn)上,沿外用套管從15 cm高處放下40 g的擊錘并撞上擊桿,使得大鼠腦部右頂葉局部受到腦挫傷,隨后使用牙托粉將骨窗封閉,并縫合大鼠頭皮。黃芪組建模前每隔12 h腹腔注射黃芪2.5 g/kg（10 mL/kg）直到相應(yīng)的時(shí)相點(diǎn),對(duì)照組用相同劑量的生理鹽水,注射方式為腹腔注射。

1.4 觀察指標(biāo)的測(cè)定

①測(cè)定EB含量:兩組大鼠在處死前1 h,均將濃度2%EB 3 mL/kg在大鼠股靜脈處注入；隨后采取斷頭取樣大鼠腦組織,并將取樣后的腦組織放置于培養(yǎng)皿中,避免水分流失；觀察大鼠中心腦組織損傷情況,并取樣損傷組織約100 mg,取樣承重后將其放置試管中保存,該試管預(yù)先注入劑量為3 mL的二甲基甲酰胺；隨后將試管放置于溫度為60 ℃水浴中,避光,并抽提24 h,離心處理10 min；量取上層離心液,并借助RF-540熒光分光光度計(jì)測(cè)定EB OD值（熒光光度值）,并選取蒸餾水作為空白對(duì)照；依據(jù)測(cè)定的光密度數(shù)值,聯(lián)系標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)大鼠腦組織中的EB含量進(jìn)行測(cè)定,并以EB含量水平（ug/g濕腦組織）來(lái)表現(xiàn)BBB通透性的變化。②大鼠腦組織中Claudin-5的表達(dá):兩組大鼠均給予相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)大鼠麻醉處理,用生理鹽水及4多聚甲醛PBS經(jīng)心臟灌注后斷頭取腦,于創(chuàng)傷灶邊緣取1 mm×1 mm×1 mm 大小的組織塊。并將其放置在濃度、成分均相同的固定液中；固定處理持續(xù)2～4 h,隨后將處理后的組織塊移人濃度為30%的蔗糖PBS緩沖液中,并置于溫度為4 ℃冰箱進(jìn)行保存,直至沉底。沿大鼠創(chuàng)傷灶中心借助冷凍切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)冠狀冷凍切片處理。對(duì)每組大鼠采取一張腦切片一個(gè)指標(biāo)的方式進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析,并借助200倍光學(xué)鏡隨機(jī)對(duì)選取創(chuàng)傷灶周邊5個(gè)相互毫無(wú)重疊視野進(jìn)行觀察,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察視野共30個(gè),記錄每個(gè)視野下該指標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)；其中Claudin-5表達(dá)蛋白采取1∶500倍進(jìn)行稀釋,而B(niǎo)-actin抗體采取1:5000倍進(jìn)行稀釋,并給予4 ℃孵育過(guò)夜處理；同時(shí)在二抗室溫持續(xù)孵育2 h；增強(qiáng)ECL發(fā)光（化學(xué)熒光反應(yīng)）,并借助軟件Chemi Imager 5500V 2.03對(duì)膠片進(jìn)行掃描,條帶積分光密度采取軟件Fluor Chem 2.0圖像分析儀進(jìn)行定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

上述大鼠數(shù)據(jù)均采取統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0進(jìn)行分析和處理；數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間對(duì)比采用t檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BBB通透性的變化情況

本文研究中借助EB滲透性實(shí)驗(yàn)對(duì)兩組大鼠BBB通透性變化進(jìn)行評(píng)估。各組腦組織EB含量于創(chuàng)傷性腦損傷后72 h時(shí)明顯升高；與對(duì)照組相比,黃芪組大鼠腦組織中EB含量水平明顯低于對(duì)照組大鼠腦組織EB含量,兩組間該項(xiàng)指標(biāo)對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）,詳細(xì)對(duì)比見(jiàn)表1。

2.2 腦組織claudin-5蛋白表達(dá)變化情況

兩組大鼠腦損傷后72 h,均發(fā)現(xiàn)Claudin-5蛋白表達(dá)含量水平明顯減少；黃芪組大鼠中claudin-5蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組,兩組間該項(xiàng)指標(biāo)對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）,見(jiàn)表1。

表l 兩組大鼠ICH后腦組織EB含量及Claudin-5蛋白表達(dá)

表l 兩組大鼠ICH后腦組織EB含量及Claudin-5蛋白表達(dá)

3 討 論

外傷性急性彌漫性腦腫脹（posttraumatic acute diffuse brain swelling,PADBS）是當(dāng)今顱腦損傷治療的難點(diǎn),有報(bào)道其病死率達(dá)到65.0%～87.2%[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),腦外傷造成的血腦屏障（blood brain barrier,BBB）破壞是產(chǎn)生血管源性腦水腫的主要原因,創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）后,其腦組織創(chuàng)傷會(huì)使得組織生理性代謝發(fā)生變化,進(jìn)而產(chǎn)生一系列的病理變化,致使BBB的生理結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞,導(dǎo)致通透性異常增加,BBB結(jié)構(gòu)的完整與否與腦水腫的形成密切相關(guān)[3]。

緊密連接由跨膜蛋白、胞質(zhì)附著蛋白和細(xì)胞骨架蛋白Actin所組成,緊密連接將內(nèi)皮細(xì)胞的腔面膜和腔對(duì)面膜分割開(kāi),起到柵欄作用；同時(shí)控制細(xì)胞旁途徑,起到閘門(mén)的作用；這也就是說(shuō)BBB中最重要的結(jié)構(gòu)為緊密連接。而病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn),Claudins（跨膜蛋白）作為緊密連接中復(fù)合物的重要構(gòu)成成分之一,其參與緊密連接的細(xì)胞極化和選擇滲透性的維持中[4]。另外,Claudin-5作為大鼠機(jī)體腦部組織中調(diào)節(jié)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞膜通透性的主要調(diào)節(jié)因此,其對(duì)BBB通透性的變化和調(diào)節(jié)起著至關(guān)重要的作用[5]。

黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜英黃芪的干燥根,其主要成分為黃芪皂苷、黃芪多糖、氨基酸、微量元素（硒、錳、鐵、鋅、銅）和鈣等。有研究表明,黃芪皂苷甲能擴(kuò)張血管,降低周?chē)茏枇?。從藥理學(xué)的角度證實(shí)黃芪具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、通經(jīng)活絡(luò)、祛除癖滯的作用。黃芪注射液具有擴(kuò)張血管、降低血壓、抗血小板凝集、改善微循環(huán)、拮抗氧自由基生成、消除過(guò)氧化脂質(zhì)的作用等,從而保護(hù)組織細(xì)胞[6]。本研究發(fā)現(xiàn),創(chuàng)傷性腦損傷后72 h,大鼠組織中BBB結(jié)構(gòu)完整度被破壞,導(dǎo)致其通透性異常升高,而在黃芪的作用下,其創(chuàng)傷后腦組織后期的BBB通透性名相下降且明顯低于對(duì)照組大鼠；同時(shí)黃芪組大鼠中Claudin-5表達(dá)蛋白水平明顯高于對(duì)照組大鼠,這說(shuō)明黃芪有助于TBI后期Claudin-5的表達(dá),進(jìn)而使得BBB的通透性得到調(diào)節(jié),緩解TBI后期的的腦水腫程度。我們推測(cè),黃芪可能通過(guò)改善顱腦損傷后腦微循環(huán),清除氧自由基和阻滯神經(jīng)細(xì)胞鈣超載,使緊密連接關(guān)閉,BBB通透性下降,而發(fā)揮減輕腦水腫的作用,其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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[2] 廖圣芳,王漢東,陳漢民,等.亞低溫治療外傷性彌漫性腫脹的臨床研究[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué),2005,12(3):373-375。

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R651.15

B

1671-8194（2014）25-0087-02

廣西教育廳立項(xiàng)項(xiàng)目（編號(hào)：201010LX261）