陸生動物診斷實驗和疫苗手冊（2013版）：蜜蜂盾螨病

徐國群鄭火青譯

（1浙江衢州出入境檢驗檢疫局，衢州324002；2浙江大學動物科學學院，杭州310016）

陸生動物診斷實驗和疫苗手冊（2013版）：蜜蜂盾螨病

徐國群1鄭火青2譯

（1浙江衢州出入境檢驗檢疫局，衢州324002；2浙江大學動物科學學院，杭州310016）

蜜蜂盾螨病(Acarapisosis or acariosis or acarine disease)是西方蜜蜂和其他蜜蜂種成年蜂的一種疾病，由跗線螨（Tarsonemid mite），也被稱為氣管螨（tracheal mite），武氏蜂盾螨(Rennie亞種)（Acarapis woodi）引起。螨蟲體長約150 μm，是蜜蜂呼吸系統(tǒng)的一種體內寄生蟲，主要在蜜蜂的前胸氣管內生活、繁殖。有時也寄生在頭、胸和腹部氣囊。螨蟲以寄主的血淋巴為食。

對被感染蜜蜂的致病作用取決于氣管內的寄生螨蟲數(shù)量，引起機械損傷和生理紊亂，并導致氣道阻塞，氣管壁病變和血淋巴衰竭。隨著寄生螨蟲數(shù)量增長，由于黑色素的緣故，氣管壁由正常的白色半透明變成不透明并帶有黑色疤痕。

死亡率中等到高。感染的早期表現(xiàn)通常被忽視，只有當感染較嚴重時臨床癥狀逐漸明顯。發(fā)病通常在早春，通過直接接觸感染。一般來說，只有新出房10天內的蜜蜂容易感染。在成年蜂氣管內繁殖，雌螨一次產(chǎn)8～20粒卵。雌螨數(shù)量是雄螨的2～4倍。雄螨發(fā)育期為11～12天，雌螨14～15天。

病原鑒定：寄生螨蟲須通過實驗室方法和顯微鏡檢診斷。觀察蜜蜂氣管內的螨蟲或者將它們移至顯微鏡下觀察。有幾種用于診斷螨蟲的技術，如解剖法、研磨法和染色法。

解剖疑似感染蜜蜂的胸部，暴露氣管。在18～20倍解剖顯微鏡下檢查每根氣管，通過透明氣管壁可見小的橢圓形螨蟲體。或將疑似感染蜜蜂的大量樣品進行研磨或在水中混勻，隨后粗過濾和離心懸浮液。沉淀物用未稀釋的乳酸處理10分鐘，然后再用顯微鏡檢查。

利用組織學技術染色，在蜜蜂氣管內可觀察到寄生螨蟲。分離氣管，用濃度8%的氫氧化鉀溶液清洗，再用濃度1%的亞甲基藍溶液染色。這是處理大量樣品的最佳方法。

血清學試驗：血清學試驗不可用。

疫苗和診斷生物制品要求：沒有可用的生物制品。薄荷醇晶體或者用植物油（不是動物脂肪）和顆粒白糖制成餅能將螨蟲數(shù)量控制在可控范圍內。

圖1 武氏蜂盾螨（Rennie亞種）。上：成年雄性，中：成年雌性，下：卵

一、介紹

蜜蜂盾螨病（Acarapisosis）是西方蜜蜂和其他蜜蜂種（Apis species）成年蜂的一種疾病，由細跗線螨科的武氏蜂盾螨（Rennie亞種）引起。螨蟲體長約150 μm，是蜜蜂呼吸系統(tǒng)的一種體內寄生蟲（圖1）。這些氣管螨侵入蜜蜂的大前胸氣管，并生長、繁殖，以寄主的血淋巴為食（圖2）。有時也寄生在頭、胸和腹部氣囊。

對蜜蜂個體的致病作用取決于氣管內寄生螨蟲的數(shù)量，同時造成機械損傷和生理紊亂，并導致氣道阻塞，氣管壁病變和血淋巴衰竭。隨著寄生螨蟲數(shù)量的增長，由于黑色素的緣故，氣管壁由正常的白色半透明變成不透明并帶有黑色疤痕。

死亡率中等到高。感染早期癥狀只是蜂群規(guī)模緩慢衰落，通常被忽視。只有當感染較嚴重時才逐漸明顯。發(fā)病通常在早春，經(jīng)過冬季的結團之后，螨蟲進行繁殖，加上沒有干擾進入越冬蜂群。這主要適用于北半球，蜜蜂繁殖有季節(jié)性變化的地區(qū)。

蜜蜂之間直接接觸造成傳染擴散。一般只有10天內新蜂易感染。嘗試用人造及合成飼料飼養(yǎng)武氏蜂盾螨未能成功，而在蜜蜂的不成熟階段培養(yǎng)它們也只是部分成功。死蜂體內中螨存活約1周。在成年蜂氣管內繁殖，雌螨一次產(chǎn)8～20粒卵。雌螨數(shù)量比雄螨多2～4倍。雄螨發(fā)育期為11～12天，雌螨14～15天。

診斷蜜蜂盾螨病缺乏典型的臨床表現(xiàn)，其感染癥狀不特定，蜜蜂的表現(xiàn)與感染其他疾病或病癥的蜜蜂大致相同。它們在蜂箱的前面爬行，在草的葉片上攀爬，不能飛行。可能同時患痢疾。

二、診斷技術

1.病原鑒定

在實驗室里僅需用顯微鏡檢查或者酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）就可檢出蜜蜂盾螨病。目前，還沒有檢出感染水平非常低的可靠方法。蜜蜂樣品的數(shù)量決定了該方法的檢測閾值。采用順序采樣，抽取50只蜜蜂樣品可檢測約1～2%的感染率，已經(jīng)證明，數(shù)據(jù)是有效的。采取蜜蜂樣本的最佳時間是在早春或晚秋（北半球），此時蜂盾螨的群體高。老齡蜂有更多的螨蟲，更容易肉眼觀察到。蜂王、雄蜂或者工蜂都可以作為樣品，但蜂盾螨偏愛雄蜂。

a）解剖法

從可疑蜂群隨機抽取50只蜜蜂樣品，主要來自蜂箱前3米范圍內爬行和不能飛行的蜜蜂。這是從蜂群中隨機取樣最好的方法。蜜蜂可能是活的、瀕死或死亡的?；罘湎扔镁凭蚶鋬觯?20℃）致死；死亡蜜蜂可在4℃保存4周，或-20℃保存幾個月，否則不能超過2～3天?？稍诜栏瘎┲虚L期保留，如Oudemann溶液：冰醋酸（80 ml）；甘油（50 ml）；70%酒精（870 ml）。

（1）直接制備法，試驗步驟：

i）從蜜蜂的胸部去掉腹部（見圖3）。

ii)由頭部頂端拿起胸部，在雙目放大鏡下放大20～30倍檢查。

iii)用一對鑷子，去除第一胸節(jié)的側胸骨片和第一對足。環(huán)形開口可見胸部氣管的主干和頭部的分支氣管。

iv)用一對細鑷子，去除第一胸節(jié)胸背甲和第二胸節(jié)部分胸背甲。清除覆蓋的肌肉，暴露兩根胸氣管。若1根或2根氣管有黑變，或在氣管內易見橢圓形的半透明體（卵等）存在（輕微感染時），可診斷為陽性。。

圖3 準備工作，用于呈現(xiàn)蜜蜂第一胸節(jié)氣管內的武氏蜂盾螨

v）如需進一步顯微鏡檢查（如確認輕微感染），取下氣管，并把它們放到一個載玻片上，加1滴水。在100倍放大倍率的顯微鏡下，可以辨別成年螨蟲以及其生長的各個階段，。

（2）浸離法，試驗步驟：

i）背朝下仰臥固定，或用拇指和食指捏住。

ii)用小鑷子去掉頭和前足，去除頸四周的頸片，暴露氣管（圖4）。檢查離氣門最近的氣管（因螨蟲通過氣門進入氣管）看是否有輕微感染。嚴重感染容易在清晰的深褐色氣管看見陰影或深色疤痕。老舊的嚴重感染將導致氣管棕色至黑色。

iii)在中間兩肢前和前翅基部位置分別用鋒利刀片切斷胸部，所得的薄圓片經(jīng)進一步處理，清除肌肉組織。

iv)浸軟，置8%氫氧化鉀溶液微加熱約20分鐘，或不加熱靜置過夜。

v)用18～20倍放大倍率的解剖顯微鏡檢查有肌肉組織覆蓋的第一對氣管，或將氣管移到另一載玻片上，加甘油或水，以更高的放大倍率觀察。

vi)通過透明的氣管壁可容易看到小的卵圓形螨蟲體。

圖4 左：前視圖，去除頭部的蜜蜂胸腔，頸片完好。右：去除頸片，氣門開口處暴露氣管

這是實驗室診斷蜜蜂盾螨病最簡單、最可靠的技術，能檢測早期感染，確定感染率。即使是輕微的感染，也可以利用這項技術，使用解剖顯微鏡進行檢測。只有在非常特殊的情況下，才有必要在診斷時采用更高的放大倍率。然而，這項技術要求較高，特別是需要診斷大量蜜蜂盾螨病。如果只需要區(qū)別嚴重感染、輕微感染或未感染的蜂群，只需要解剖至第二步，觀察氣管的顏色即可。

b)研磨法

隨機從疑似感染蜂群中抽取200只蜜蜂樣品。從胸部去除每只蜜蜂的翅和足，將剩余身體部分浸入盛有四分之一水的100 ml容器中。加入更多水，將懸浮液以10000 rpm在勻漿器上勻漿3次，每次幾秒鐘。將所得懸浮液用篩（目數(shù)0.8mm）過濾，并且用水沖洗篩，得到最終體積近50 ml的液體。將濾液1500轉離心5分鐘，棄上清液。沉淀物可能含有螨蟲，加幾滴未經(jīng)稀釋過的乳酸溶液。靜置10分鐘，使肌肉纖維溶解。然后裝在一個蓋玻片鏡檢。

這項技術比解剖法更快，但不夠精確。體外寄生螨外蜂盾螨、游離蜂盾螨和背蜂盾螨,在外觀上與武氏蜂盾螨相似，在健康蜜蜂的胸部常常可以發(fā)現(xiàn)，很容易被誤認為是武氏蜂盾螨（表1）。然而他們并不對蜜蜂或養(yǎng)蜂業(yè)造成嚴重威脅。因此，這種方法只能用于粗略估計一個地區(qū)感染程度，不適合用于第一次暴發(fā)時確診。

表1 Acarapis種的鑒別診斷

c）染色法

對螨蟲和氣管進行特別染色，顯微鏡下易見。

測試步驟：

i）去掉頭和前足。

ii）在前足后面的膜狀區(qū)域橫切一刀。

iii）在前翅的基部，中間一對腿前面，再橫切一刀。

iv）切片（1～1.5mm厚）清理干凈后，置8%氫氧化鉀溶液。

v）輕輕攪拌，加熱至接近沸點約10分鐘，直至軟的內部組織溶解、清除，保持幾丁質組織完好。

vi）用自來水過濾，清洗，取回切片。

vii）染色，封固切片。

viii）在低倍顯微鏡下檢查螨蟲。

通常的組織學技術可以制備永久封固切片。

陽離子染料是最合適和特效的，因為他們對螨蟲染色強，而對氣管染色弱。最合適的是1%的亞甲基藍水溶液，可以先將亞甲基藍溶解，再加入氯化鈉，制成0.85%氯化鈉溶液。

試驗步驟：

i）用1%亞甲基藍水溶液染色。

ii）切片在蒸餾水中分化2～5分鐘。

iii）切片用70%酒精沖洗。

當用95%酒精保存時，螨可再著色6小時。這種技術的關鍵是在氫氧化鉀溶液中有效浸軟組織。使用這種方法可以迅速和方便地處理大量樣品。

d）酶聯(lián)免疫吸附方法

已經(jīng)研制出診斷氣管螨的ELISA方法。這種方法可能會產(chǎn)生假陽性結果，因此只建議用于普查。另一種方法是觀察鳥糞素——螨蟲的含氮代謝廢物。

三、所需疫苗和診斷生物制品

沒有可用的生物制品。薄荷醇晶體（50 g可用于一個雙層的蜂群）防治螨類只要在蜂群里放置28天，要求環(huán)境溫度至少18℃。氣化的最適溫度范圍為27～29℃。用氫化植物油（如人造奶油，不含動物脂肪）和白糖制成的小糖餅將螨發(fā)病率控制低至10%。糖餅（約100 g重）應在秋季和早春放置在巢箱框梁頂部。甲酸可用于治療受侵染的蜂群。

蜜蜂的一些品種（系），如布克法斯特蜜蜂（Buckfast bees）和善于清潔的品系，較少受到蜂盾螨的侵染。