電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測維生素D試劑盒性能驗(yàn)證

何國堅(jiān)* 肖 慶 韋慶文

（深圳市龍崗中心醫(yī)院，廣東 深圳 518116）

電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測維生素D試劑盒性能驗(yàn)證

何國堅(jiān)* 肖 慶 韋慶文

（深圳市龍崗中心醫(yī)院，廣東 深圳 518116）

目的在羅氏CS E170分析儀采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測維生素D，評(píng)價(jià)其試劑盒性能指標(biāo)。方法參考美國全國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（NCCLS）的EP系列文件，對(duì)電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測維生素D試劑盒性能指標(biāo)做出評(píng)估。結(jié)果電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測維生素D有較好的穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)的檢出限為3.0 ng/mL；兩種不同濃度的定值質(zhì)控血清在準(zhǔn)確度評(píng)估中相對(duì)偏差（Bias%）均＜8%；三種不同濃度的臨床患者混合血清及兩種不同濃度的定值質(zhì)控血清評(píng)估精密度批內(nèi)、批間變異系數(shù)（CV%）均＜5%；在線性范圍評(píng)價(jià)中均為發(fā)現(xiàn)離群點(diǎn)，線性回歸方程為y=0.0181+0.988x，r=0.988。稀釋變異P為0.45（P0.05=0.6841），P＜0.05，稀釋變異可接受，線性失擬檢查G=3.22（F0.05=3.29），G＜ F0.05，線性良好；干擾試驗(yàn)以相對(duì)偏差＜8%為醫(yī)學(xué)決定水平，T-Bil濃度≤360 μmol/L，Hb濃度≤4.0 g/L，維生素D測定相對(duì)偏差在可接受范圍；Hb濃度≥4.0 g/L，可引起維生素D測定結(jié)果升高，相對(duì)偏差尚在可接受范圍；Hb濃度≥9.0 g/L，引起維生素D測定結(jié)果升高超出可接受范圍。結(jié)論CS E170分析儀電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測維生素D試劑盒穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍、抗干擾能力均符合臨床檢驗(yàn)要求。

維生素D；電化學(xué)發(fā)光免疫分析法；性能驗(yàn)證

維生素D是一種脂溶性類固醇激素前體，主要由皮膚經(jīng)光照后產(chǎn)生。維生素D本身無生物活性，必須在肝臟和腎臟相繼接受兩次羥基化才能生成具有生物活性1，25-羥基維生素D。 維生素D的兩種重要形式包括維生素D3（膽鈣化醇）和維生素D2（麥角鈣化醇）。與維生素D3不同，人體不能合成維生素D2，只能從強(qiáng)化食品或食品補(bǔ)充劑中獲取。

羅氏E170分析儀維生素D檢測利用維生素D結(jié)合蛋白 （VDBP）作為捕獲蛋白，結(jié)合維生素D3（25-OH）和維生素D2（25-OH）。EIecsys維生素D檢測具有高靈敏度，且所受影響因素較少，能自動(dòng)化批量操作。我們?cè)诹_氏CS E170分析儀采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測維生素D，參考美國全國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（NCCLS）的EP系列文件，對(duì)試劑盒性能指標(biāo)做出評(píng)估，現(xiàn)分析如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑：羅氏CS 170E全自動(dòng)分析儀，試劑及質(zhì)控品為羅氏原廠試劑。R1為BPRu標(biāo)記的維生素D結(jié)合蛋白；釕標(biāo)記的維生素D結(jié)合蛋白；pH 7.5；R2為生物素標(biāo)記的25-羥基維生素D；生物素化25-羥基維生素D；pH 8.6。試劑批號(hào)為174625。使用廠家提供標(biāo)準(zhǔn)品及質(zhì)控品。質(zhì)控1批號(hào)171270，靶值21.3 ng/mL；質(zhì)控2批號(hào)170777，靶值43.6 ng/mL。

1.2 檢測原理：競爭法原理，總檢測時(shí)間：27 min；儀器自動(dòng)通過2點(diǎn)校正的定標(biāo)曲線計(jì)算得到檢測結(jié)果。

1.3 方法：參考NCCLS的EP系列文件，對(duì)試劑盒儲(chǔ)存穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度、線性范圍及干擾實(shí)驗(yàn)做出性能評(píng)估。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS12.0及EXCEL軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定性：以蒸餾水代替樣本監(jiān)測試劑空白吸光值（Abs1）評(píng)價(jià)試劑穩(wěn)定性，連續(xù)測定1個(gè)月，試劑穩(wěn)定，已超過說明書開封后放置在CS 170E上穩(wěn)定28 d的指標(biāo)。評(píng)價(jià)樣本穩(wěn)定性采用選擇8份在試劑盒線性范圍內(nèi)（3～70 ng/mL）不同濃度臨床樣本血清，注意排除溶血及黃疸標(biāo)本，連續(xù)測定維生素D 2次取平均值，置于4 ℃保存4 d，解凍連續(xù)測定維生素D 2次取平均值，采用t檢驗(yàn)比較各樣本2次均值差異，結(jié)果各樣本2次均值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有較好的穩(wěn)定性。

2.2 檢出限：以25次試劑空白均值+3S計(jì)算檢出限，本方法檢出限為≤2.0 μg/mL，根據(jù)說明書，低于檢出限報(bào)告維生素D≤3.0 μg/mL。

2.3 準(zhǔn)確度：采用兩種不同濃度的定值質(zhì)控血清各重復(fù)測定3次，計(jì)算各濃度均值（）及相對(duì)偏差（Bias%），以相對(duì)偏差＜8%為醫(yī)學(xué)決定水平，評(píng)價(jià)試劑盒準(zhǔn)確度，結(jié)果見表1。

不同濃度兩種定值血清相對(duì)偏差均＜8%，試劑盒測試準(zhǔn)確度評(píng)估合格。

2.4 精密度：以三種不同濃度的臨床患者混合血清及兩種不同濃度的定值質(zhì)控血清為檢測對(duì)象，每日檢測2次（間隔時(shí)間>2 h），連續(xù)檢測10日，評(píng)價(jià)方法的批內(nèi)及批間變異系數(shù)（CV%），結(jié)果見表2。

參照美國NCCLS機(jī)構(gòu)EP文件要求，批內(nèi)、批間不精密度均＜5%，試劑盒檢測精密度符合要求。

2.5 線性范圍評(píng)價(jià)：在試劑盒標(biāo)定的線性范圍（3.00～70 ng/mL）取高濃度血清樣本（60.4 ng/mL）為5號(hào)樣本及低濃度樣本血清（4.12 ng/mL）為1號(hào)樣本，二者3∶1混合為2號(hào)樣本，等份混勻?yàn)?號(hào)，1∶3混合為4號(hào)，2～4號(hào)樣本濃度計(jì)算公式：標(biāo)本濃度=（C1V1+C5V5）/（V1+V5），C為濃度，V為體積。隨機(jī)排列，每個(gè)標(biāo)本測定4次，當(dāng)天完成測定，離群點(diǎn)檢查P0.05=0.885，本組數(shù)據(jù)均為發(fā)現(xiàn)離群點(diǎn)，采用線性回歸分析，線性回歸方程為y=0.0181+0.988x，r=0.988，稀釋變異P為0.45（P0.05=0.6841），P＜0.05，稀釋變異可接受，線性失擬檢查G=3.22（F0.05=3.29），G＜ F0.05，線性良好。

2.6 干擾試驗(yàn)：選取含總膽紅素（T-Bil）濃度360 μmol/L，血紅蛋白（Hb）濃度9 g/L的干擾物，將干擾物與臨床混合血清混合制成不同濃度血清干擾物混合物，檢測相對(duì)偏差，評(píng)價(jià)不同干擾物濃度對(duì)試劑盒檢測影響，結(jié)果見表3。

以相對(duì)偏差＜8%為醫(yī)學(xué)決定水平，T-Bil濃度≤360 μmol/L，Hb濃度≤4.0 g/L，維生素D相對(duì)偏差尚在可接受范圍。Hb濃度≥4.0 g/L引起維生素D測定結(jié)果升高，Hb濃度≥9.0 g/L引起維生素D測定結(jié)果升高超出可接受范圍。

表1 兩種不同濃度定值質(zhì)控血清測定結(jié)果：（ng/L）

表2 臨床混合血清、定值質(zhì)控血清重復(fù)性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)結(jié)果

表3 干擾試劑盒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

維生素D是維持骨骼健康的主要元素。兒童期維生素D的嚴(yán)重缺乏將致骨骼畸形，即佝僂病。輕度缺乏將導(dǎo)致食物鈣的利用度下降[1]。維生素D缺乏將導(dǎo)致肌肉乏力；對(duì)于中老年人，維生素D對(duì)肌肉功能的影響還將增加跌倒風(fēng)險(xiǎn)[2]。維生素D缺乏是導(dǎo)致繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥的主要原因。PTH水平升高，特別是對(duì)于中老年維生素D缺乏人群，可導(dǎo)致骨軟化癥，骨轉(zhuǎn)換增加，骨量減少，骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。維生素D（25-OH）濃度降低與骨密度降低有關(guān)。 結(jié)合其他臨床資料，檢測結(jié)果有助于評(píng)估骨代謝情況。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)維生素D可影響200多種不同基因的表達(dá)。維生素D缺乏與糖尿病、不同種類的癌癥、心血管疾病、自身免疫性疾病和先天性免疫疾病有關(guān)[3]。

血清25-OHD測定是衡量VD營養(yǎng)狀態(tài)的最佳指標(biāo)，由于25-OHD的測定結(jié)果直接影響對(duì)VD營養(yǎng)狀況的判斷，測定結(jié)果準(zhǔn)確與否、不同的測定方法之間是否一致，至關(guān)重要?，F(xiàn)有多種方法用于臨床25-OHD的測定，根據(jù)方法原理，可分為免疫分析法和色譜法。免疫分析法只能測定25-OHD總量，無法同時(shí)測定25-OHD2和25-OHD3的濃度?，F(xiàn)有色譜法可區(qū)分并能分別定量25-OHD2和25-OHD3。免疫分析法是早期VD測定的主流方法。

目前常用方法有：①放射免疫法（RIA），靈敏度高、特異性強(qiáng)、精密度好，儀器設(shè)備條件要求不高，是基層單位對(duì)超微量物質(zhì)測定的主要手段，但存在放射污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)。②酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）：設(shè)備和操作簡單，無污染，但敏感性和特異性較差。③化學(xué)發(fā)光免疫測定法（CLIA）：具有操作簡單、快速、無同位素污染等優(yōu)點(diǎn)，容易自動(dòng)化，適合在臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展。Leino等分析比較了羅氏E170電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀與RIA、HPLC、LC-MS/MS檢測25-OHD3結(jié)果的符合性，發(fā)現(xiàn)ECLIA法與LC-MS/MS、RIA檢測結(jié)果的一致性較好[4-6]。

HPLC是早期應(yīng)用較多的色譜法之一，靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性都較高，但設(shè)備較貴，標(biāo)本前處理過程復(fù)雜。操作程序較復(fù)雜，需要更昂貴的特殊儀器，不適合臨床常規(guī)開展。

由于檢測方法學(xué)的局限，目前尚無血清25-OHD的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。為保證檢測方法的準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性，我們對(duì)羅氏E170電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)檢測血清維生素D試劑盒進(jìn)行評(píng)估。評(píng)估結(jié)果表明：電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測維生素D的檢出限為3.0 ng/mL；兩種不同濃度的定值質(zhì)控血清在準(zhǔn)確度評(píng)估中相對(duì)偏差（Bias%）均＜8%；三種不同濃度的臨床患者混合血清及兩種不同濃度的定值質(zhì)控血清評(píng)估精密度批內(nèi)、批間變異系數(shù)（CV%）均＜5%；在線性范圍評(píng)價(jià)中均為發(fā)現(xiàn)離群點(diǎn)，線性回歸方程為y=0.0181+0.988x，r=0.988。稀釋變異P為0.45（P0.05=0.6841），P＜0.05，稀釋變異可接受，線性失擬檢查G=3.22（F0.05=3.29），G＜ F0.05，線性良好；干擾試驗(yàn)以相對(duì)偏差＜8%為醫(yī)學(xué)決定水平，T-Bil濃度≤360 μmol/L，Hb濃度≤4.0 g/L，維生素D測定相對(duì)偏差在可接受范圍；Hb濃度≥4.0 g/L，可引起維生素D測定結(jié)果升高，相對(duì)偏差尚在可接受范圍；Hb濃度≥9.0 g/L，引起維生素D測定結(jié)果升高超出可接受范圍。CS E170分析儀電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測維生素D試劑盒穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍、抗干擾能力均符合臨床檢驗(yàn)要求。

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R392

B

1671-8194（2014）23-0076-02

深圳市龍崗區(qū)科創(chuàng)委課題，編號(hào)LG20140519093453

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